Διερεύνηση της επίδρασης της φυσιολογίας των εκφύτων, καθώς και του υποστρώματος και των συνθηκών καλλιέργειας στον μικροπολλαπλασιασμό του xMalosorbus Florentina Zucc.

Abstract

Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν να αναπτυχθεί ένα αποτελεσματικό πρωτόκολλο in vitro πολλαπλασιασμού του σπάνιου και απειλούμενου αυτοφυούς τη ελληνικής χλωρίδας xMalosorbus florentina με στόχο την αξιοποίησή του ως καλλωπιστικό φυτό και συγχρόνως τη διατήρησή του. Βασικά προβλήματα που έπρεπε να αντιμετωπιστούν κατά την in vitro καλλιέργεια ήταν οι μολύνσεις και το καφέτιασμα των εκφύτων κατά την αρχική εγκατάσταση καλλιεργειών και η δυσκολία κατά την in vitro ριζοβολία των μικροβλαστών. Ως βασικό υπόστρωμα in vitro καλλιέργειας χρησιμοποιήθηκε το MS με 1.0 mg l-1 BA και 0.1 mg l-1 IBA. Έκφυτα που ελήφθησαν από ενήλικα φυτά, έκφυτα κορυφής βλαστού και έκφυτα συλλεγμένα το Μάρτιο και Απρίλιο εμφάνισαν περισσότερο καφέτιασμα και είχαν υψηλότερο περιεχόμενο σε ολικά φαινολικά από ότι έκφυτα που ελήφθησαν από νεανικό ιστό, κομβικά έκφυτα και αυτά που συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια οποιουδήποτε άλλου μήνα του χρόνου. Η περιεκτικότητά των εκφύτων σε λιγνίνη, η οποία υπολογίστηκε με τη χρήση φασματοσκοπίας FT-IR, ήταν χαμηλότερη στα επάκρια από ότι τα κατώτερα έκφυτα, ενώ δεν παρατηρήθηκαν διαφορές ως προς την προέλευση ή την εποχή συλλογής των εκφύτων. Διακριτική ανάλυση των φασμάτων IR στην περιοχή 1450-1700 cm-1, όπου βρίσκονται οι κορυφές των φαινολικών συστατικών και της λιγνίνης, με το πρόγραμμα TQ analyst ομαδοποίησε τα φάσματα των εκφύτων ως προς τη θέση, την προέλευση και την εποχή συλλογής τους. Μικροσκοπική παρατήρηση επάκριων εκφύτων που συλλέχθηκαν από κανονικές ή λογχοειδείς βλαστήσεις ενήλικων φυτών σε μηνιαία βάση κατά τη διάρκεια ενός έτους έδειξε πως υπήρχε αγγειακή σύνδεση των οφθαλμών με το βλαστό και πως τρίχες κάλυπταν τα λέπια και τα νεαρά φύλλα των οφθαλμών. Στα παρεγχυματικά κύτταρα παρατηρήθηκε συσσώρευση αμύλου από τον Ιούλιο μέχρι το Σεπτέμβριο και γέμισμα με ινώδεις κατασκευές από τον Οκτώβριο μέχρι τον Ιανουάριο, καθώς και κρύσταλλοι του οξαλικού ασβεστίου καθ' όλο το έτος. Έκφυτα κορυφής από ενήλικα φυτά του όρους Πάρνηθα ήταν πιο δύσκολο να εγκατασταθούν in vitro (14%) συγκριτικά με έκφυτα από μικροπολλαπλασιασμένα φυτάρια ή αναβλαστήσεις φυτών καμένων κατά την πυρκαγιά του 2007 στην Πάρνηθα (29-36%). Έκφυτα κόμβου από in vitro ανεπτυγμένα σπορόφυτα εγκαταστάθηκαν στο υψηλότερο ποσοστό (83%), δίνοντας τους περισσότερους βλαστούς ανά έκφυτο (5.2). Έκφυτα κόμβου από τη βάση αναβλαστήσεων παρήγαγαν βλαστούς σε υψηλότερο ποσοστό (60%) από ότι έκφυτα από

ανώτερες θέσεις (20-31%), αλλά οποιεσδήποτε διαφορές στους ρυθμούς πολλαπλασιασμού των εγκατεστημένων καλλιεργειών σταμάτησαν μετά την τρίτη υποκαλλιέργεια. Έκφυτα από μικροπολλαπλασιασμένα φυτάρια εγκαταστάθηκαν σε υψηλότερο ποσοστό όταν καλλιεργήθηκαν σε υπόστρωμα με 1.0 mg l-1 TDZ (54%). Το TDZ και η ΒΑ έδωσαν περισσότερους βλαστούς ανά έκφυτο (3.3) από τις zeatin, kinetin και 2iP ή το μάρτυρα χωρίς φυτορυθμιστικές ουσίες, οι βλαστοί όμως στο υπόστρωμα με TDZ δεν επιμηκύνθηκαν. Μετά από υποκαλλιέργεια στο βασικό υπόστρωμα, τα έκφυτα από το TDZ ξεπέρασαν αυτά από τη BA και τα άλλα υποστρώματα στον αριθμό των βλαστών (4.0 βλαστοί/ έκφυτο) χωρίς να υπολείπονται στο μήκος των βλαστών. Γενικά, οι in vitro καλλιέργειες που εγκαταστάθηκαν από ενήλικα φυτά, εκτός μιας, επέδειξαν χαμηλότερους ρυθμούς πολλαπλασιασμού συγκρινόμενες με καλλιέργειες από αναβλαστήσεις ή μικροπολλαπλασιασμένα φυτάρια, ενώ τα έκφυτα από σπορόφυτα έπρεπε να μεταχειριστούν με 0.5 mg l-1 GA3 για να αυξήσουν το δυναμικό πολλαπλασιασμού τους. Η κάλυψη των δοχείων καλλιέργειας με μεμβράνη sanitas περιόρισε το πρόβλημα της υπερενυδάτωσης των βλαστών που εμφανιζόταν με τη χρήση πλαστικού φιλμ ή πλαστικού καπακιού, ενώ ταυτόχρονα αύξησε το ρυθμό πολλαπλασιασμού των εκφύτων. Η ΒΑ αποδείχθηκε πιο αποτελεσματική για τον πολλαπλασιασμό των βλαστών σε σύγκριση με τις zeatin και 2iP, ενώ η kinetin θεωρήθηκε ακατάλληλη αφού οδήγησε στο σχηματισμό περιορισμένου αριθμού κοντών βλαστών ακατάλληλων για ριζοβολία. Η παρουσία ΙΒΑ (0.1 mg l-1) στο υπόστρωμα πολλαπλασιασμού των βλαστών αύξησε το δυναμικό πολλαπλασιασμού. Επίπεδα κυτοκινίνης μεταξύ 1.0 και 2.0 mg l-1 συντέλεσαν στην παραγωγή υψηλού αριθμού βλαστών χωρίς να περιορίζεται σημαντικά το μήκος τους. Η αντικατάσταση της ΒΑ του βασικού υποστρώματος από TDZ σε συγκεντρώσεις 0.1-2.0 mg l-1 έδωσε υψηλότερους ρυθμούς πολλαπλασιασμού των βλαστών, επέδρασε όμως αρνητικά στην επιμήκυνση των βλαστών. Η μεταφορά βλαστών και συσσωμάτων βλαστών από υπόστρωμα με TDZ στο βασικό υπόστρωμα με πλήρη ή μισή συγκέντρωση ΒΑ και ΙΒΑ επέφερε την επιμήκυνσή τους. Η χρήση χαμηλής συγκέντρωσης TDZ (0.1 mg l-1) προτείνεται σε εναλλασσόμενες με ΒΑ καλλιέργειες, δεδομένου ότι αυξάνει τη βλαστογένεση συγκριτικά με τη συνεχή χρήση του ΒΑ. Παρόλο που το WPM αύξησε τη βλαστογένεση, το MS προτιμήθηκε του WPM επειδή οι μικροβλαστοί που παράχθηκαν στο WPM εμφάνισαν συμπτώματα stress και ριζοβόλησαν σε χαμηλότερο ποσοστό από αυτούς που είχαν παραχθεί σε MS. Μικροβλαστοί που καλλιεργήθηκαν σε στερεό υπόστρωμα ^MS με αυξίνη για προτροπή ριζοβολίας για μία μόνο εβδομάδα ακολουθούμενη από καλλιέργεια σε υπόστρωμα χωρίς φυτορυθμιστικές ουσίες ριζοβόλησαν σε υψηλότερο ποσοστό και σχημάτισαν λιγότερο κάλο από αυτούς που καλλιεργήθηκαν συνεχώς στο υπόστρωμα με αυξίνη. Οι μικροβλαστοί που παράχθηκαν σε καλλιέργεια που προήλθε από ενήλικο φυτό ριζοβόλησαν σε υψηλότερο ποσοστό (32%) στο υπόστρωμα με συνδυασμό 0.5 mg l-1 IBA και 8.0 mg l-1 IAA, ενώ οι μικροβλαστοί που παράχθηκαν σε καλλιέργεια που προήλθε από αναβλαστήσεις ρφιζοβολούσαν σε υψηλότερο ποσοστό (65%) στο υπόστρωμα που περιείχε μόνο ΙΑΑ (4.0 ή 8.0 mg l-1). Η μέθοδος της σύντομης εμβάπτυνσης της βάσης των μικροβλαστών σε υγρό διάλυμα 1000 mg l-1 ΙΒΑ ήταν λιγότερο αποτελεσματική στην πρόκληση ριζοβολίας, ενώ αύξησε το σχηματισμό κάλου. Η εφαρμογή σκότους κατά την πρώτη εβδομάδα καλλιέργειας στο υπόστρωμα προτροπής ριζοβολίας δε συνιστάται επειδή οδήγησε στην παραγωγή υπερβολικής ποσότητας κάλου στη βάση των μικροβλαστών χωρίς να συνεισφέρει σημαντικά στη βελτίωση του ποσοστού ριζοβολίας. Προσθήκη ενεργού άνθρακα (2 g l-1) στο υπόστρωμα προτροπής ριζοβολίας παρεμπόδισε πλήρως τη ριζοβολία των μικροβλαστών, ενώ όταν προστέθηκε στο υπόστρωμα ανάπτυξης των ριζών, κατά την πρώτη εβδομάδα μόνο, αύξησε το ποσοστό ριζοβολίας και μείωσε το σχηματισμό κάλου. Οι μικροβλαστοί που είχαν παραχθεί σε υπόστρωμα με χαμηλή συγκέντρωση κυτοκινίνης γενικά ριζοβόλησαν σε υψηλότερα ποσοστά από αυτούς που προέρχονταν από υψηλότερη συγκέντρωση κυτοκινίνης. Οι μικροβλαστοί από νεανικές καλλιέργειες ήταν πιο ικανοί για ριζοβολία (51-58%) σχηματίζοντας περισσότερες ρίζες από ότι αυτοί από καλλιέργειες ενήλικων φυτών (16-32%). Υψηλότερα ποσοστά εγκλιματισμού και ταχύτερος ρυθμός ανάπτυξης των φυταρίων επιτεύχθηκε από εύρωστα φυτάρια με πλούσιο ριζικό σύστημα, που μεταφέρθηκαν ex vitro σε υπόστρωμα τύρφης-περλίτη 1:1 (v/v), τέλος χειμώνα-αρχές άνοιξης. Το 83% των φυταρίων εγκλιματίστηκε ex vitro ανεξάρτητα από την προέλευσή τους, και τα φυτάρια νεανικής προέλευσης, παρόλο που ανέπτυξαν το ίδιο ύψος με αυτά που προέρχονταν από ενήλικα φυτά, είχαν κοντύτερα μεσογονάτια και συνεπώς πιο συνεκτική μορφή. Η προσθήκη ενεργού άνθρακα στο υπόστρωμα ανάπτυξης των ριζών in vitro ευνόησε τον ακόλουθο εγκλιματισμό, αυξάνοντας το ποσοστό επιβίωσης των φυταρίων (μέχρι 100%).

Aim of this study was to develop an effective in vitro protocol for the propagation of rare and endangered native plant of Greek flora xMalosorbus florentina in order to use it as an ornamental landscape plant as well as for its conservation. This species is, so its micropropagation will contribute to its conservation. Main problems that had to be addressed during in vitro culture were contamination and browning of explants during initial culture establishment and difficulty during in vitro rooting of microshoots. MS with 1.0 mg l -1 BA and 0.1 mg l -1 IBA was used as basal in vitro culture medium. Explants excised from adult plants, shoot tip explants and explants collected in March and April showed more browning and had higher content of total phenols than explants excised from juvenile tissue, nodal explants and those collected during any of the other months of the year. Explants content in lignin, which was estimated using FT-IR spectroscopy, was lower in apical than in lower explants, while differences as regards to origin or season of explants collection were not observed. Discriminant analysis of IR spectra in the region of 1450-1700 cm -1 , where peaks of phenolic compounds and lignin are found, with TQ analyst grouped spectra of explants as regards their location, their origin and the season of their collection. Microscopic observation of apical explants excised from normal shoots or spurs of adult plants, monthly during one year, showed that there was a vascular connection of buds with shoot and that hairs covered scales and young leaves of buds. In parenchymal cells, starch accumulation from July through September and fill with fibrous structures from October to January, as well as crystals of calcium oxalate throughout the year were observed. Apical explants excised from adult plants growing wild on Mt. Parnitha were more difficult to establish in vitro (14%) compared to explants excised from micropropagated plantlets or sprouts of burned plants during fire of 2007 in Panitha (29-36%). Nodal explants excised from in vitro grown seedlings were established at the highest percentage (83%), giving the most shoots per explants (5.2). Nodal explants from the base of sprouts produced shoots at higher percentage (60%) than explants from upper locations (20-31%), but any differences in proliferation rates of established cultures ceased after the third subculture. Explants form micropropagated plantlets were established at higher percentage when they were cultured in medium with 1.0 mg l -1 TDZ (54%). TDZ and ΒΑ gave more shoots per explants (3.3) than zeatin, kinetin and 2iP or the control without plant growth regulators, but shoots in medium with TDZ were not elongated. After subculture in basal medium, explants from TDZ surpassed those from BA and other media in shoot number (4.0 shoots/ explant) without falling short in shoot length. Generally, in vitro cultures established from adult plants, with the exception of one culture, showed lower multiplication rates compared to cultures from sprouts or micropropagated plantlets, while explants from seedlings had to be treated 0.5 mg l -1 GA in order to increase their proliferation potential. Cover of culture vessels with sanitas membrane limited the problem of shoots hyperhydricity that was appearing with the use of plastic film or plastic cap, while it simultaneously increased proliferation rate of explants. ΒΑ was proved more effective for shoot proliferation compared to zeatin and 2iP, while kinetin was considered inappropriate since it led to the formation of a limited number of short shoots unsuitable for rooting. Presence of ΗΒΑ (0.1 mg l 3 -1 ) on the medium of shoot proliferation increased multiplication rate. Cytokinin levels between 1.0 and 2.0 mg l -1 contributed to the production of high shoot number without significant restriction of their length. Replacement of BA of the basal medium from TDZ in concentrations 0.1-2.0 mg l gave higher shoot proliferation rates, having though a negative effect in shoots elongation. Transfer of shoots and shoot clusters from medium with TDZ to basal medium with full or half concentration of BA and IBA brought their elongation. Use of low concentration of TDZ (0.1 mg l -1 ) in alternate cultures with BA is proposed, since it increases blastogenesis compared to continuous use of BA. Although WPM increased blastogenesis, MS was preferred to WPM because microshoots produced in WPM showed symptoms of stress and rooted at lower percentage than those produced in MS. Microshoots cultured in solid ½MS medium wit h auxin for root induction for only one week followed by culture in medium without plant growth regulators rooted at higher percentage and formed less callus than those cultured continuously in medium with auxin. Microshoots produced in culture established from adult plant rooted at higher percentage (32%) in medium with combination of 0.5 mg l -1 IBA and 8.0 mg l IAA, while microshoots produced in culture established from sprouts rooted at higher percentage (65%) in medium containing only ΗΑΑ (4.0 or 8.0 mg l -1 ). Method of brief dipping of microshoots base in liquid solution 1000 mg l -1 ΗΒΑ was less effective in root induction, while it increased callus formation. Application of darkness during the first week of culture in root induction medium is not recommended because it led to the production of excessive callus at the base of microshoots without contributing significantly to the improvement of rooting percentage. Addition of AC (2 g l ) on root induction medium completely inhibited microshoots rooting, while when it was added on the medium of root elongation, only during the first week, it increased rooting percentage and reduced callus formation. Microshoots produced in medium with low concentration of cytokinin generally rooted at higher percentages than those coming from higher cytokinin concentration. Microshoots excised from juvenile cultures were more capable to root (51-58%) forming more roots than those excised from cultures of adult plants (1632%).

Higher acclimatization percentages and faster growth rate of plantlets was succeeded by robust plantlets with rich root system, that were transferred ex vitro in mixture of peat-perlite 1:1 (v/v), end of winter-early spring. The 83% of plantlets was acclimatized ex vitro independently of their origin, and plantlets of juvenile origin, although developing the same height as those originating from adult plants, had shorter internodes and thus more compact shape. Addition of AC in the medium of root elongation in vitro favored following acclimatization, increasing percentage of plantlets survivor (up to 100%).