O σκοπός της πρώτης ενότητας της παρούσας εργασίας ήταν η διερεύνηση της μικροχλωρίδας παραδοσιακών Ελληνικών τυριών Π.Ο.Π., η απομόνωση νέων στελεχών και η μελέτη των βιοχημικών/τεχνολογικών τους ιδιοτήτων που σχετίζονται με το δυναμικό εφαρμογής τους ως εναρκτήριες καλλιέργειες σε ζυμώσεις τυριών. Έτσι, διερευνήθηκε η μικροβιακή χλωρίδα των τυριών Φορμαέλλα, Κοπανιστή, Φέτα και Μάνα (Κοπανιστής). Από αυτά τα δείγματα απομονώθηκαν 133 ‘άγρια’ οξυγαλακτικά βακτήρια, τα οποία ταυτοποιήθηκαν με φαινοτυπικές μεθόδους. Οι μεσόφιλοι γαλακτοβάκιλλοι αποτέλεσαν την κυρίαρχη μικροχλωρίδα. Στη συνέχεια μελετήθηκαν οι βιοχημικές/τεχνολογικές ιδιότητες των απομονώσεων. Τα θερμόφιλα στελέχη (γαλακτοβάκιλλοι και κόκκοι) παρουσίασαν την καλύτερη οξυπαραγωγική ικανότητα, ενώ οι θερμόφιλοι γαλακτοβάκιλλοι αποτέλεσαν τα πιο πρωτεολυτικά στελέχη. Οι θερμόφιλοι κόκκοι είχαν τις υψηλότερες πεπτιδολυτικές αλλά και εστερολυτικές δραστικότητες. Μόνο πέντε στελέχη ήταν λιπολυτικά και κανένα από τα υπό εξέταση στελέχη δεν βρέθηκε να καταβολίζει το κιτρικό οξύ ως μοναδική πηγή άνθρακα. Η ανάλυση των παραγόμενων μεταβολιτών των απομονώσεων με τη μέθοδο GC-MS σε συνδυασμό με την επακόλουθη στατιστική ανάλυση των κυρίων συνιστωσών, διαχώρισαν τις απομονώσεις σε ομάδες, οι οποίες μάλιστα συμπίπτουν με την φαινοτυπική ομαδοποίηση. Η ανάλυση των πτητικών ενώσεων μέσω της ανάλυσης ‘e-nose’ επέδειξε παρόμοια αποτελέσματα. Η μέθοδος SDS-PAGE, PFGE και η αλληλούχηση του γονιδίου 16S rRNA, έδειξε ότι οι Lb. rennini και Lb. acidipiscis ήταν τα μοναδικά μικροβιακά είδη που απομονώθηκαν από τα δείγματα της Κοπανιστής και της Μάνας. Αυτά τα στελέχη παρήγαγαν αλκοόλες και αλδεΰδες ως κύριες πτητικές ενώσεις, οι οποίες προέρχονται από δευτερογενή καταβολισμό αμινοξέων και οι οποίες έχουν σημαντική συνεισφορά στο σχηματισμό του αρώματος και της γεύσης στα τυριά.
Στη συνέχεια εξετάστηκε η δυναμική τεσσάρων ‘άγριων’ οξυγαλακτικών βακτηρίων (Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus, S. thermophilus, Lb. paracasei subsp. paracasei και E. faecalis), απομονωμένων από το προηγούμενο στάδιο και επιλεγμένων με βάση τα αποτελέσματα των βιοχημικών/τεχνολογικών ιδιοτήτων τους, στην πιλοτική παραγωγή ενός τυριού παρασκευασμένου από γίδινο γάλα. Το τυρί αναλύθηκε μικροβιολογικά, φυσικοχημικά και οργανοληπτικά κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης (30 ημερών). Οι πληθυσμοί των εναρκτήριων καλλιεργειών αυξήθηκαν τις πρώτες 24 h και μετά παρέμειναν σταθεροί κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης. Το τελικό προϊόν ήταν ένα μαλακό τυρί με ήπιο άρωμα/γεύση, καλή υφή και καλά μικροβιολογικά και φυσικοχημικά χαρακτηριστικά.
Η δεύτερη ενότητα της παρούσας μελέτης αφορά τη διερεύνηση της απόκρισης του Lb. acidipiscis σε συνθήκες ωσμωτικού στρες. Ο Lb. acidipiscis ACA-DC 1533 που απομονώθηκε από το δείγμα της παραδοσιακής Κοπανιστής (πρώτη ενότητα) παρουσίασε έναν ευδιάκριτο αλοανθεκτικό φαινότυπο. Ο σκοπός αυτής της ενότητας ήταν ο εντοπισμός μηχανισμών που ενεργοποιούνται στο βακτήριο αυτό σε συνθήκες ωσμωτικού στρες, καθώς και ο προσδιορισμός των πιθανών εμπλεκόμενων ωσμωλυτών. Οι μεταγραφικές αλλαγές των κυττάρων του Lb. acidipiscis σε ισο- και υπερωσμωτικές συνθήκες μελετήθηκαν με τη μέθοδο RAP-PCR, χρησιμοποιώντας ένα αυθαίρετο εκκινητή για να ενισχυθεί το ολικό RNA. Το παραγόμενο cDNA αναλύθηκε με ηλεκτροφόρηση. Ακολούθησε σύγκριση των αποτυπωμάτων RNA που προέκυψαν, μεταξύ των κυττάρων που είχαν υποβληθεί σε υπερωσμωτικό στρες και των κυττάρων μαρτύρων και οι ζώνες που παρουσίασαν ποσοτικές διαφορές, κλωνοποιήθηκαν και αλληλουχήθηκαν. Η σύγκριση των αλληλουχιών στις βάσεις δεδομένων επέτρεψε το χαρακτηρισμό έξι γονιδίων διαφορικής έκφρασης, καθώς και την ανίχνευση πλασμιδιακού DNA που φέρει το στέλεχος. Η τεχνική της RT-PCR χρησιμοποιήθηκε για την επιβεβαίωση των αλλαγών στα προφίλ του RNA του στελέχους. Ανάμεσα στα γονίδια που βρέθηκαν να επάγονται στην υψηλή ωσμωμοριακότητα ήταν και αυτά που κωδικοποιούν την IIB και ΙΙΑ υπομονάδα του συστήματος PEP-PTS της μαννόζης/σορβόζης. Η ανάπτυξη του Lb. acidipiscis σε 10% (w/v) NaCl παρουσίασε σημαντική βελτίωση όταν προστέθηκε στο μέσο μαννόζη ή/και σορβόζη ακόμα και σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις της τάξης των 1 μM. Η ωσμωπροστατευτική δράση αλλά και η συγκέντρωση στην οποία αυτή επιτεύχθηκε ήταν συγκρίσιμες με τις αντίστοιχες άλλων γνωστών βακτηριακών ωσμωλυτών όπως η γλυκίνη-βεταΐνη. Αυτό το γεγονός υποδεικνύει ότι η μαννόζη και η σορβόζη αποτελούν δυο νέους ωσμωλύτες. Επιπλέον, σε ενζυμικό επίπεδο η ενεργότητα του συστήματος μαννόζης/σορβόζης αυξήθηκε κατά προσέγγιση επί 1.8 φορές σε κύτταρα που είχαν εκτεθεί σε υψηλή συγκέντρωση NaCl σε σχέση με τα κύτταρα μάρτυρες.
Στο τρίτο στάδιο της μελέτης διερευνήθηκε το πλασμιδιακό περιεχόμενο τριών ‘άγριων’ οξυγαλακτικών βακτηρίων (απομονωμένων όπως περιγράφεται στην πρώτη ενότητα), με σκοπό τον εντοπισμό γονιδίων που πιθανώς να συνεισφέρουν σε τεχνολογικές ιδιότητες. Αρχικά χαρακτηρίστηκε το πλασμίδιο pLAC1 του στελέχους Lb. acidipiscis ACA-DC 1533 που απομονώθηκε από το δείγμα της Κοπανιστής. Το pLAC1 έχει μέγεθος 3478 bp και η ab initio ανάλυση έδειξε τέσσερα orfs. Τα orf1 και orf4 βρέθηκαν να κωδικοποιούν μια πρωτεΐνη-εκκινητή αντιγραφής (Rep) και μια πρωτεΐνη κινητοποίησης (Mob), αντίστοιχα. Οι προκύπτουσες πρωτεΐνες των orf2 και orf3 δεν έδειξαν σημαντική ομολογία με άλλες γνωστές πρωτεΐνες. Παρόλα αυτά, η in silico εξέταση της πλασμιδιακής αλληλουχίας πρόβλεψε την ύπαρξη ενός νέου οπερονίου που περιλαμβάνει τα rep, orf2 και orf3 του πλασμιδίου pLAC1 αλλά επίσης έδειξε ότι αυτό το οπερόνιο είναι συντηρημένο και στα συγγενικά του πλασμίδια. Η αντίδραση RT-PCR επιβεβαίωσε το γεγονός ότι αυτά τα τρία γονίδια συν-μεταγράφονται ως ένα πολυσιστρονικό μόριο mRNA. Επιπλέον, η φυλογενετική ανάλυση των πρωτεϊνών Rep και Mob του πλασμιδίου pLAC1 έδειξε ότι αυτές οι δυο πρωτεΐνες πιθανώς προέρχονται από διαφορετικές πλασμιδιακές πηγές, υποδηλώνοντας ότι το pLAC1 αποτελεί προϊόν συναρμολόγησης κατά την εξελικτική διαδικασία. Από τη συγκριτική ανάλυση της ολικής νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του pLAC1 με τα συγγενικά του πλασμίδια φάνηκε ότι το pLAC1 πιθανώς απέκτησε το mob ως αποτέλεσμα ενός προγονικού ανασυνδυασμού γονιδίων. Αυτά τα συμπεράσματα συμβάλουν στην καλύτερη εκτίμηση της διαφοροποίησης και της εξέλιξης των πλασμιδίων στα οξυγαλακτικά βακτήρια.
Στη συνέχεια, απομονώθηκε το πλασμίδιο pREN από τον Lb. rennini ACA-DC 1534 το οποίο αλληλουχήθηκε και χαρακτηρίστηκε. Η ab initio ανάλυση του pREN (μεγέθους 4371 bp) αποκάλυψε την ύπαρξη έξι πιθανών orfs πάνω στον ίδιο κλώνο του DNA, με τα orf1 και orf2 να σχηματίζουν ένα νέο οπερόνιο. Το orf1 κωδικοποιεί την πρωτεΐνη RepA ενώ το προκύπτον πεπτίδιο του orf2 δεν εμφάνισε ομοιότητα με άλλες γνωστές πρωτεΐνες. Σύμφωνα με την ανάλυση TBLASTN, αυτή η δομή του οπερονίου repA-orf2 εντοπίστηκε επίσης στα πλασμίδια pLB925A03 και pLJ42. Τα υπόλοιπα τέσσερα orfs βρέθηκαν να κωδικοποιούν διαφορετικές πρωτεΐνες Mob σε διαδοχική διάταξη (mobC, mobA1, mobA2 και mobB). Περαιτέρω ανάλυση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας των mobA1 και mobA2 αποκάλυψε μια μετάλλαξη μετατόπισης πλαισίου στο γονίδιο mobA που είχε ως αποτέλεσμα τη δημιουργία αυτών των δυο ψευδογονιδίων. Στην περιοχή της αλληλουχίας που προηγείται του γονιδίου repA, εντοπίστηκε το πιθανό σημείο έναρξης της αντιγραφής (ori) που περιλαμβάνει μια περιοχή με μεγάλο ποσοστό αδενίνης και θυμίνης με επαναλαμβανόμενα 11-μερή (περιοχή ΑΤ), ακολουθούμενη από τις 22-μερείς επαναλήψεις (iteron). Αυτές οι δυο περιοχές διαχωρίζονται από ένα μεσοδιάστημα μήκους 37 bp που αποτελεί την ενδιάμεση, μεταβλητή περιοχή. Η συγκεκριμένη οργάνωση του σημείου ori σε συνδυασμό με το μοτίβο ομοιότητας της πρωτεΐνης RepA, καθιστά το πλασμίδιο pREN ως ένα νέο μέλος της οικογένειας πλασμιδίων pUCL287 που πολλαπλασιάζονται με το μηχανισμό αντιγραφής θήτα. Η μέθοδος στοίχισης πολλαπλών ακολουθιών εφαρμόστηκε στις περιοχές oris των πλασμιδίων της οικογένειας pUCL287 και τα αποτελέσματα έδειξαν ένα υψηλό επίπεδο συντήρησης στην περιοχή ΑΤ, ένα σημαντικό επίπεδο συντήρησης στη μεταβλητή περιοχή και τέσσερα χαρακτηριστικά επαναλαμβανόμενα 10-μερή στην iteron περιοχή που ήταν σχεδόν πανομοιότυπα. Η ανάλυση προσομοίωσης της αναδίπλωσης του DNA εμφάνισε τρεις δυνητικούς βρόγχους (έναν στη μεταβλητή περιοχή και δύο ίδιους στην iteron περιοχή) του πεδίου ori τόσο στο pREN όσο και στα υπόλοιπα πλασμίδια της ίδιας οικογένειας. Αυτές οι δευτεροταγείς δομές προκύπτουν από τις συντηρημένες αλληλουχίες της περιοχής ori. Η συγκριτική ανάλυση της αλληλουχίας των pREN, pLB925A03 και pLJ42 κατέδειξε ότι αυτά τα πλασμίδια διατηρούν μια διαφορετική δομή του σκελετού αντιγραφής και κινητοποίησης μέσα στην οικογένεια pUCL287. Η φυλογενετική ανάλυση των πρωτεϊνών του πλασμιδίου pREN, καθώς και των pLB925A03 και pLJ42 αποδεικνύει ότι αυτά τα μόρια απέκτησαν τα γονίδια mob κατόπιν μιας εξελικτικής πορείας συναρμολόγησης. Επιπρόσθετα, όλα τα προαναφερόμενα πλασμίδια φαίνονται να έχουν κοινό προγονικό μόριο με πλασμίδια από εντερόκοκκους.
Τέλος, αναλύθηκε και μελετήθηκε το νέο πλασμίδιο pPS1 απομονωμένο από το στέλεχος P. pentosaceus ACA-DC 3431. Το πλασμίδιο αυτό φέρει το γονίδιο που κωδικοποιεί μια ομόλογη πρωτεΐνη επαγόμενη από έλλειψη γλυκόζης στα βακτήρια Bacillalles (GsiB). Η GsiB είναι μια χαρακτηριστική πρωτεΐνη απόκρισης σε γενικευμένα στρες και ανήκει στο σίγμα-Β (σΒ) ρεγουλόνιο σε πολλά Gram θετικά βακτήρια. Η GsiB του pPS1 βρέθηκε να είναι παρόμοια με την πρωτεΐνη Gsp του πλασμιδίου pLS141-1, απομονωμένου από τον Lb. sakei καθώς και την GsiB του χρωμοσωμικού τμήματος του P. acidilactici 7_4. Η πρωτεΐνη GsiB δεν ανιχνεύτηκε σε άλλα οξυγαλακτικά βακτήρια, τα οποία στερούνται τον παράγοντα σΒ. Η εξέταση της πρωτεϊνικής αλληλουχίας της GsiB αποκάλυψε την ύπαρξη χαρακτηριστικών μοτίβων των φυτικών πρωτεϊνών εμβρυογένεσης τελικού σταδίου (late-embryogenesis-abundant proteins, LEA). H φυλογενετική ανάλυση έδειξε ότι τα οξυγαλακτικά βακτήρια έχουν αποκτήσει τις πρωτεΐνες GsiB από έναν κοινό πρόγονο με τους Paenibacillus/Geobacillus. Αυτό υποδηλώνει ότι οι GsiB πρωτεΐνες αποκτήθηκαν με οριζόντια μεταφορά γονιδίων (Horizontal Gene Transfer, HGT) και ότι πιθανότατα ο αρχικός δότης ήταν οργανισμός που ανήκει στην οικογένεια Bacillales. Τα δεδομένα αυτά συνηγορούν στο ότι η GsiB αποτέλεσε μια "κινητή μονάδα" στο πλασμίδιο pLS141-1 ή σε κάποια προγονική μορφή του. Αυτό το πλασμίδιο φαίνεται ότι ήταν σε θέση να ξεπεράσει το φράγμα των ειδών, δεδομένου ότι σχετίζεται άμεσα με τα ρεπλικόνια των pMA67/pLS55 που αναπαράγονται τόσο σε οξυγαλακτικά όσο και σε βακτήρια Bacillales. Συνεπώς, η GsiB ενδεχομένως να μεταφέρθηκε μετά από ανασυνδυασμό σε άλλα πλασμίδια οξυγαλακτικών βακτηρίων, όπως το pPS1, ή και στο χρωμόσωμα κυττάρων-δεκτών, π.χ. το γονιδίωμα του P. acidilactici 7_4. Αυτή η εργασία αποτελεί την πρώτη έκθεση για την ύπαρξη της πρωτεΐνης GsiB σε οξυγαλακτικά βακτήρια.
Είναι πλέον τεκμηριωμένο ότι η ‘άγρια’ μικροβιακή χλωρίδα των τροφίμων αυθόρμητης ζύμωσης αποτελεί μια σημαντική πηγή ανεξερεύνητων μικροοργανισμών. Αυτό επιβεβαιώθηκε και στην παρούσα μελέτη καθώς από δείγματα παραδοσιακών Ελληνικών τυριών καταφέραμε να απομονώσουμε δυο εξαιρετικά σπάνια οξυγαλακτικά βακτήρια που μάλιστα έχουν σχετικά πρόσφατα περιγραφεί. Οι Lb. rennini και Lb. acidipiscis παρουσίασαν ενδιαφέρουσες τεχνολογικές ιδιότητες όσον αφορά την παραγωγή καρβονυλικών πτητικών ενώσεων. Επιπλέον, ο Lb. acidipiscis έδειξε ένα σημαντικό αλοανθεκτικό φαινότυπο καθώς βρέθηκε να αναπτύσσεται ακόμα και σε συγκέντρωση 10% χλωριούχου νατρίου. Η περαιτέρω διερεύνηση των πιθανών μηχανισμών απόκρισης αυτού του βακτηρίου σε υπερωσμωτικές συνθήκες, οδήγησε στον προσδιορισμό της μαννόζης και της σορβόζης ως δυο νέων ωσμωλυτών. Τέλος, από τη μελέτη του πλασμιδιακό περιεχόμενο επιλεγμένων άγριων οξυγαλακτικών βακτηρίων, προέκυψαν σημαντικά συμπεράσματα όσον αφορά την εξέλιξη και διαφοροποίηση των μορίων αυτών. Επιπρόσθετα, το πλασμίδιο pPS1 φέρει το γονίδιο gsiB και αυτή η μελέτη αποτελεί την πρώτη αναφορά ύπαρξης αυτού του γονιδίου στα οξυγαλακτικά βακτήρια ενώ ταυτόχρονα αναλύεται ο πιθανός μηχανισμός με τον οποίο αυτά τα βακτήρια το απέκτησαν.
The aim of the first section of this study was to explore the microbiota of traditional Greek P.D.O. cheeses, the isolation of new strains and the investigation of their biochemical/technological properties that are related to their potential application as starter cultures in cheese production. Therefore, the microbiota of Formaella, Kopanisti and Feta cheeses, and also of Mana was explored. From these samples, a total of 133 wild lactic acid bacteria were isolated and phenotypically characterised. Mesophilic lactobacilli were the most abundant group. Concerning their technological properties, thermophilic strains (lactobacilli and cocci) were the best milk acidifiers, whereas thermophilic lactobacilli were the most proteolytic isolates. Higher peptidolytic and esterolytic activities were obtained with thermophilic cocci. Only five isolates were lipolytic, whereas none was able to catabolize citrate as a sole carbon source. GC-MS analysis of the metabolites produced and subsequent principal components analysis revealed segregated clusters of isolates in accordance with the phenotypic groups. E-nose analysis revealed similar results, but the alignment with phenotypic groups was not as strong. The SDS-PAGE, the PFGE analysis and the 16S rRNA gene sequencing, revealed that Lb. rennini and Lb. acidipiscis were the sole microbial species in Kopanisti cheese and Mana. The major volatile compounds produced by these strains were alcohols and aldehydes deriving from secondary amino acid catabolism that are important flavor compounds in cheeses.
The potential application of four wild strains of lactic acid bacteria (Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus, S. thermophilus, Lb. paracasei subsp. paracasei και E. faecalis) as starter cultures was surveyed in a pilot-scale cheese making using goat’s milk. These strains were isolated as described previously and were selected on the basis of their technological properties. The cheese was analysed microbiologically, physicochemically and organoleptically through a 30-day period of ripening. Counts of the starter cultures increased in the first 24h and then remained stable during ripening. The end product was a soft cheese characterized by a mild, aromatic taste, a smooth structure, as well as good microbiological and physicochemical properties.
The second section of this study involved the assessment of the response mechanism of Lb. acidipiscis under osmotic stress. Lb. acidipiscis ACA-DC 1533 that was isolated from traditional Kopanisti cheese (first section) exhibited a significant halotolerant phenotype. The aim of this part was to identify putative mechanisms that are activated in this bacterium under conditions of high osmolarity and also to determine compounds that could act as osmolytes. The transcriptional changes of the bacterium due to adaptation to hypertonic environments were studied with the RAP-PCR method, using an arbitrary primer so as to amplify total RNA. The produced cDNA produced was resolved by electrophoresis. The resulting fingerprints were compared and bands exhibiting differences in abundance between control and stressed cells were excised, cloned and sequenced. BLAST searched resulted in the identification of six differentially expressed genes as well as the trace of plasmid DNA carried by the strain. RT-PCR verified the transcriptional changes of the total RNA profiles. Growth of Lb. acidipiscis in the presence of 10% (w/v) NaCl was significantly enhanced by the addition of mannose or sorbose at concentrations as low as 1 μM in the growth medium. The osmoprotective effect as well as the concentration required, were comparable to those of well known bacterial osmolytes like glycine-betaine. Furthermore, mannose/sorbose PTS activity was increased approximately by 1.8-fold in cells exposed to high NaCl concentrations in comparison to control cells.
In the third section of this study the plasmid content of three ‘wild’ lactic acid bacteria (isolated as described in the first section) was investigated so as to identify genes that may contribute to the technological properties of these bacteria.
Firstly, the pLAC1 plasmid of Lb. acidipiscis ACA-DC 1533, a strain isolated from traditional Kopanisti cheese, was characterised. Nucleotide sequence analysis revealed a molecule of 3478 bp and ab initio annotation indicated four putative orfs. orf1 and orf4 were found to encode a replication initiation protein (Rep) and a mobilization protein (Mob), respectively. The deduced products of orf2 and orf3 revealed no significant homology to other known proteins. However, in silico examination of the plasmid sequence supported the existence of a novel operon that includes rep, orf2 and orf3 in pLAC1 and that this operon is highly conserved also in its related plasmids. RT-PCR experiments verified that these three genes are co-transcribed as a single polycistronic mRNA species. Furthermore, phylogenetic analysis of pLAC1 Rep and Mob proteins demonstrated that they may have derived from different plasmid origins, suggesting that pLAC1 is a product of a modular evolution process. Comparative analysis of full length nucleotide sequences of pLAC1 and related plasmids showed that pLAC1 acquired mob probably via an ancestral recombination event. These conclusions contribute to the better evaluation of the divergence and evolution of plasmids in lactic acid bacteria.
Plasmid pREN deriving from Lb. rennini ACA-DC 1534, isolated from traditional Kopanisti cheese, was sequenced and characterized. pREN was found to be a molecule of 4371 bp and ab initio orf calling revealed that the plasmid carries six putative genes located on the same DNA strand. orf1 and orf2 were predicted to form a novel operon with orf1 coding for a replication initiation protein (RepA), while the deduced product of orf2 showed no similarity to other known proteins. According to our analysis, the repA-orf2 operon structure could also be detected in plasmids pLB925A03 and pLJ42. The four remaining orfs were all found to encode different mobilization proteins in a sequential fashion, namely mobC, mobA1, mobA2 and mobB. Further inspection of the mobA1 and mobA2 sequences revealed that a frameshift mutation in the mobA gene resulted in the generation of these two pseudogenes. A putative origin of replication (ori) was detected that contained an AT-rich region with 11-mer repeats followed by 22-mer iterons. The two regions were separated by a 37 bp spacer called the variable region. This organization of the pREN ori along with the similarity pattern of its RepA clearly demonstrated that the plasmid belongs to the pUCL287 family of theta-replicating plasmids. Multiple sequence alignment of the oris of pUCL287 family demonstrated a high degree of conservation throughout the AT-rich region, a significant degree of conservation in the variable region and four characteristic 10-mer repeats in the iteron region that were almost identical among the plasmids. Three stem loops, one in the variable region and two identical in the iteron region were predicted in the ori of pREN after DNA folding simulations. Similar secondary structures were also present in the oris of all plasmids of the family that were mostly driven by the conserved sequences among them. Comparative analysis of pREN, pLB925A03 and pLJ42 showed that they retain a unique combination in the architecture of their replication and mobilization elements within the pUCL287 family. Phylogenetic analysis of the pREN proteins established that this plasmid as well as pLB925A03 and pLJ42 have undergone a modular evolutionary process in order to acquire their mob genes. In addition, all three plasmids were found to have a common ancestor with several enterococcal plasmids. Our work highlights the need to characterise plasmids from uncommon lactic acid bacteria in order to better explore their evolution and divergence.
Finally, plasmid pPS1, isolated from Pediococcus pentosaceus ACA-DC 3431, was found to carry a gene encoding a homolog to the Bacillaceae glucose starvation-inducible protein B (GsiB). GsiB is a characteristic general stress protein (Gsp) of the σΒ regulon in several Gram-positive bacteria. Very similar to pPS1 GsiB was Gsp on plasmid pLS141-1 isolated from Lactobacillus sakei and GsiB on a chromosomal contig of Pediococcus acidilactici 7_4. No other sequences related to pPS1 GsiB could be identified in lactic acid bacteria (LAB), a group of bacteria devoid of σΒ. Inspection of the protein sequence revealed the existence of highly hydrophilic 20-amino acid tandem repeats that are typical for Group 1 late-embryogenesis-abundant (LEA) plant proteins. Phylogenetic analysis demonstrated that LAB GsiBs share a common ancestor with the GsiB of Paenibacillus/Geobacillus, suggesting that the former proteins were acquired through horizontal gene transfer (HGT) and that most probably the original donor was a Bacillales organism. Our data support that GsiB became a ‘mobile unit’ in plasmid pLS141-1 or an ancestral version of it. This plasmid seems to be able to overcome the species barrier, as it is related to the pMA67/pLS55 replicon that efficiently replicates in both LAB and Bacillales. We propose that the gsiB could have been transferred from this point on by recombination to other LAB plasmids, like pPS1, or to the chromosome of recipient cells, e.g. the genome of P. acidilactici 7_4. This is the first report for the existence of GsiB in LAB.
It is now well documented that the “wild” microbiota of naturally fermented foods comprises a major source of undiscovered microorganisms. This was also confirmed in this study as we managed to isolate from Greek cheeses two extremely rare lactic acid bacteria species, which have been described quite recently. Lb. rennini and Lb. acidipiscis showed interesting technological properties regarding the production of volatile carbonyl compounds. Furthermore, Lb. acidipiscis exhibited a significant osmotolerant phenotype as it could grow at even 10% (w/v) concentration of sodium chloride. Further inspection of the possible response mechanisms of this bacterium under hyperosmotic conditions, led to the identification of mannose and sorbose as two novel osmolytes. Finally, the study of plasmid content of selected wild lactic acid bacteria reached important conclusions about the evolution and diversification of these molecules. Additionally, plasmid pPS1 carries the gsiB gene and this study is the first report of the existence of this gene in lactic acid bacteria and at the same time the putative mechanism by which these bacteria acquired it is being proposed.
