Μοριακός χαρακτηρισμός των γονιδίων της εστεράσης της ορμόνης νεότητας στο έντομο S.nonagrioides

Abstract

Οι ορμόνες νεότητας (JHs) αποτελούν έναν από τους βασικότερους ρυθμιστές του βιολογικού κύκλου των εντόμων. ΢ε συνεργασία με τα εκδυστεροειδή ρυθμίζουν την μετάβαση των εντόμων στα διάφορα αναπτυξιακά τους στάδια και οργανώνουν τις μεταμορφωτικές τους δραστηριότητες, ενώ σημαντικός είναι ο ρόλος τους και για την αναπαραγωγή τους, αφού σε πολλά είδη οι JHs υποκινούν την βιοσύνθεση της βιτελλογενίνης (Hartfelder, 2000). H αποδόμηση των JHs στους ιστούς και την αιμολέμφο είναι ένας σημαντικός τρόπος ελέγχου του τίτλου τους, ενώ οι εστεράσες της ορμόνης νεότητας (juvenile hormone esterases, JHEs) αποτελούν ρυθμιστικά ένζυμα-κλειδιά για την διαδικασία αυτή. ΢ε προηγούμενη εργασία (Kοντογιαννάτος, 2008) απομονώθηκε και χαρακτηρίστηκε το cDNA του γονιδίου που κωδικοποιεί για μία εστεράση της ορμόνης νεότητας (SnoJHE) στο έντομο Sesamia nonagrioides (Lepidoptera: Noctuidae). Σο γονίδιο του ενζύμου αυτού κλωνοποιήθηκε και αλληλουχήθηκε. Σο μέγεθος του μεταγραφήματος στο τελευταίο προνυμφικό στάδιο ήταν 1.85kb και η προκύπτουσα από το cDNA κλώνο αμινοξική ακολουθία περιείχε όλα τα πέντε λειτουργικά μοτίβα, τα οποία εμφανίζονται στις περισσότερες εστεράσες, πρωτεάσες και λιπάσες. Ενδείξεις για ύπαρξη περισσοτέρων του ενός γονιδίων στο γονιδίωμα του εντόμου, μας οδήγησε σε περαιτέρω διερεύνηση για την πιθανή εύρεση επιπροσθέτων JHE cDNA κλώνων. cDNA από λιπώδη ιστό προνυμφών 4ου και 5ου προνυμφικού σταδίου χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα σε αντιδράσεις πολυμερισμού (PCR) με εξειδικευμένους εκκινητές. Από τις αντιδράσεις αυτές προέκυψαν 6 προϊόντα μεγέθους 1725bp, 1411bp, 1556bp, 1119bp, 1000bp και 1250bp αντίστοιχα. Σο προϊόν των 1725bp (SnoJHE1) αλληλουχήθηκε και εμφάνιζε 100% ομολογία με το πρώτο cDNA που χαρακτηρίστηκε (SnoJHE), ενώ τα προϊόντα των 1411bp, 1556bp και 1119bp αντιστοιχούσαν σε 3 νέα JHE cDNAs, τα SnoJHE2, SnoJHE3 και SnoJHE4 αντίστοιχα. Για να ερευνηθεί εάν τα τέσσερα μεταγραφήματα ήταν προϊόντα εναλλακτικού ματίσματος ενός γονιδίου ή προϊόντα διαφορετικών γονιδίων, εφαρμόστηκε η τεχνική του υβριδισμού κατά Southern. Από τον υβριδισμό καθώς και από γονιδιωματικά δεδομένα εκτιμάται ότι τέσσερα γονίδια κωδικοποιούν για JHEs στο έντομο S. nonagrioides.

Juvenile hormone (JH) plays major roles in control of growth, development, metamorphosis, diapause and reproduction in insects. The regulation of JH titers is thus critical in entire life of the insect. One key event is the clearing of JH that generally precedes the molt from the last larval stage to the pupal stage of holometabolous insects (Campbell et al., 2001). The very low JH titer at this time is generally achieved by the combined effect of reduced JH synthesis and by JH degrading enzymes. Degradation of JH in tissues and in hemolymph is a major way which hormone titers are regulated, and JH esterase (JHE) has been thought to play key roles in the metabolism of JH, (P.J.Gullan;P.S.Cranston, 2005). In previous study, we isolated and characterized a juvenile hormone esterase gene (SnoJHE) from the moth Sesamia nonagrioides (Lepidoptera: Noctuidae). The size of this transcript in the last instar was 1.85 kb long and the predicted protein contained all five functional domains which are presented in most esterases, proteases and lipases. Evidence of more than one JHE genes in Sesamia nonagrioides led us to further investigate the presence of additional JHE cDNA clones. cDNA prepared from fat body of 4th and 5th instar larvae, was used as template in PCR reactions using specific primers. These reactions resulted in 6 products with size of 1725bp, 1411bp, 1556bp, 1119bp, 900bp and 1250bp respectively. The product of 1725bp (SnoJHE1) has been sequenced and corresponded to SnoJHE, while the products of 1411bp, 1556bp and 1119bp, corresponded to 3 new JHEs, SnoJHE2, SnoJHE3 and SnoJHE4 respectively. To investigate if these three new cDNAs were products of multiple alternative splicing events or products of different genes scattered in the genome of the corn stalk borer we performed southern blot hybridization using as probe an EcoRI digested part of SnoJHE1 cDNA. Southern blot hybridization revealed that there are more than one JHE genes in Sesamia nonagrioides genome. Genomic sequencing results also showed, that there are four JHE genes in S.nonagrioides genome. These genes (JHEgV1, JHEgV2, JHEg1, JHEg2) seem to be products of several recent evolutionary events. This is the first report showing that the evolution of species is a developing event that happens even in nowadays. Whoever is the nature and the reasons of this evolution, JHE genes in S.nonagrioides constitute an appreciable example of recent evolutionary processes and require further investigation, reminding simultaneously the importance of JHEs in insect growth and physiology.