Κατιούσα διεργασία απαμινάσης αδενοσίνης από αίμα ανθρώπου

Abstract

Η απαμινάση αδενοσίνης (adenosine deaminase, ADA) είναι ένα ένζυμο που εμπλέκεται στον μεταβολισμό των πουρινών. Ειδικότερα, καταλύει την μη αντιστρεπτή απαμίνωση αδενοσινο-νουκλεοσιδίων (αδενοσίνης και 2´-δεοξυαδενοσίνης) σε ινοσινο-νουκλεοσίδια (ινοσίνη και 2´-δεοξυ-ινοσίνη). Η κληρονομική ανεπάρκεια της ADA ενοχοποιείται για την ονομαζόμενη ‘σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια’ (ADA-SCID) που οφείλεται σε δυσλειτουργικά T- και Β-λεμφοκύτταρα, και αδυναμία ανάκαμψης του οργανισμού ακόμα και από ήπιας μορφής ασθένειες. Η κύρια θεραπευτική μέθοδος προβλέπει τη χορήγηση ADA μόσχου, τροποποιημένης επιφανειακά με πολυαιθυλενογλυκόλη (Pegademase). Ελλείψει εγκεκριμένου κλωνοποιημένου θεραπευτικού προϊόντος, η βελτίωση της κατιούσας διεργασίας ADA από αίμα ανθρώπου εξακολουθεί να παρουσιάζει πρακτικό ενδιαφέρον. Η παρούσα μελέτη επικεντρώνεται στον μερικό καθαρισμό απαμινάσης αδενοσίνης 1 (ADA1) από ερυθροκύτταρα ανθρώπου. Προς τούτο, τα ερυθροκύτταρα απομονώνονται από αίμα ανθρώπου, λύονται σε νερό και φυγοκεντρούνται. Το υπερκείμενο απαλλάσσεται από την αιμοσφαιρίνη μετά από προσρόφηση της τελευταίας σε κατιοντοανταλλάκτη Sephadex C-50, το δε λαμβανόμενο εκχύλισμα (διατηρείται στους -20°C για περίπου 3 εβδομάδες, χωρίς απώλεια δραστικότητας ADA) καθαρίζεται μερικώς σε στήλη ανιοντοανταλλάκτη Sepharose DE-50 μετά από έκλουση με αυξανόμενη συγκέντρωση NaCl σε ρυθμιστικό διάλυμα ιμιδαζολίου-ΗCl, 30 mM, pH 6. Η εν λόγω στήλη ιοντοανταλλάκτη παρουσιάζει δυναμική χωρητικότητα 0,52 units ADA ανά mL προσροφητή. Τα κλάσματα που συλλέγονται αναλύονται για δραστικότητα ADA (units) και περιεκτικότητα σε συνολική πρωτεΐνη (A280). Εκείνα που παρουσιάζουν τη μεγαλύτερη δραστικότητα (10 mM έως 50 mM NaCl) αναλύονται με τη μέθοδο του Bradford για την περιεκτικότητά τους σε πρωτεΐνη (ειδική δραστικότητα 0.27 units/mg και καθαρισμός 5,6-φορές). Το λαμβανόμενο μερικώς καθαρισμένο εκχύλισμα με ADA, αποτελεί το ‘αρχικό υλικό’ για μελλοντικές μελέτες πλήρους καθαρισμού του ενζύμου, χρησιμοποιώντας χρωματογραφία συγγένειας βασισμένη σε νέους λογικά σχεδιασμένους συνθετικούς δεσμευτές. Παράλληλα, πραγματοποιήθηκε και μελέτη που περιελάμβανε την κλωνοποίηση του γονιδίου της hADA1 σε προκαρυωτικό φορέα. Για την κλωνοποίηση του γονιδίου χρησιμοποιήθηκαν δύο συνθετικοί κλώνοι του εμπορίου (κατόπιν παραγγελίας), ένας που ήταν “untagged” και ένας που ήταν “tagged” με His6. Και στις δύο περιπτώσεις το γονίδιο ενισχύθηκε μέσω PCR και κλωνοποιήθηκε σε πλασμίδιο χρησιμοποιώντας ομόλογο ανασυνδυασμό. Διαφορετικά στελέχη έκφρασης Ε. coli χρησιμοποιήθηκαν και ελέγχθηκαν μέσω ανάλυσης SDS-PAGE. Σκοπός της εργασίας αυτής είναι η σύγκριση των αποτελεσμάτων καθαρισμού ADA που ελήφθησαν χρησιμοποιώντας αίμα ανθρώπου και προκαρυωτικό σύστημα έκφρασης.

Adenosine deaminase is an enzyme of the purine metabolism which catalyzes the irreversible deamination of adenosine and deoxyadenosine to inosine and deoxyinosine, respectively. Inherited ADA deficiency causes severe combined immunodeficiency disease (ADA-SCID) which derives from disfunctional T- and B-cells and leads to the inability of the organism to thrive even in cases of mild diseases. The main course of treatment consists of enzyme replacement using polyetheneglycol-modified bovine ADA (Pegademase). A potential method of therapy could be the isolation of the human enzyme itself from human blood, which can be found in great quantities. This work focuses on the partial purification of adenosine deaminase, isoenzyme 1 (ADA1) from human red blood cells. Briefly, the erythrocytes from human blood of healthy donors are harvested, disintegrated in cold water and the lysate centrifuged. The supernatant is batch-processed on a cation-exchanger Sephadex C-50 to remove the hemoglobin. The extract (which remains stable at -20°C for approximately 3 weeks without any loss of activity) is then partially purified on an anion-exchanger Sepharose DE-50 column using increasing salt concentrations in 30mM imidazole-HCl, pH 6. The fractions collected are analyzed for ADA activity (units) and total protein content (A280), and those with peak activity (from 10 mM to 50 mM NaCl) are further analyzed using the Bradford method in order to determine their protein concentration (0.27 units/mg and 5.6-purification fold). The partially purified extract (i.e. starting material) should be suitable for future affinity chromatography studies based on novel synthetic materials. At the same time, a sub-project was implemented which included the cloning of hADA1 in a prokaryotic system. A codon optimized gene of hADA1 was ordered. There were two clones, one tagged and one untagged. The gene, in both cases, was amplified through PCR and cloned in a plasmid using homologous recombination. Different E. coli expression strains were tested followed by SDS-PAGE analysis. This sub-project concerns the purification of hADA1 from recombinant bacterial cells and, if promising results are obtained, will be used to assess the enzyme purification processes, starting from human blood and a prokaryotic system.