Διερεύνηση του ρόλου των γονιδίων των β-αμυλασών στην ανθεκτικότητα των φυτών έναντι βιοτροφικών, ημιβιοτροφικών και νεκροτροφικών φυτοπαθογόνων μικροοργανισμών

Abstract

Ο ρυθμιστικός ρόλος των προϊόντων του βασικού μεταβολισμού στην ενεργή άμυνα των φυτών δεν έχει κατανοηθεί πλήρως, ενώ φαίνεται να είναι εξειδικευμένος στις διάφορες σχέσεις παρασιτισμού μεταξύ των παθονόνων και των φυτών-ξενιστών. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε ο ρόλος των γονιδίων των β-αμυλασών (BAMs) με θέση δράσης στο στρώμα του χλωροπλάστη ως προς την αύξηση της ανθεκτικότητας ή της ευπάθειας των φυτών έναντι βιοτροφικών, ημιβιοτροφικών και νεκροτροφικών παθονόνων μικροοργανισμών. Για το σκοπό αυτό, πραγματοποιήθηκαν πειράματα παθογένειας σε μεταλλαγμένες στα γονίδια ΒΑΜ1, ΒΑΜ2, ΒΑ Μ 3 και ΒΑΜ4 σειρές Α. thaliana με το βιοτροφικό παθογόνο ωομύκητα Hyaloperonospora arabidopsidis, το παθογόνο βακτήριο Pseudomonas syringae ρν. tomato DC3000 (Pst DC3000) και το νεκροτροφικό μύκητα Botrytis cinerea. Στα πειράματα παθογένειας με τον ωομύκητα Η. arabidopsidis, τα αποτελέσματα τόσο της ποσοτικοποίησης των ζωοσποριαγγείων όσο και η συμπτωματολογική εικόνα των φυτών στις 12 ημέρες μετά τη μόλυνση κατέδειξαν αυξημένη ανθεκτικότητα των γονότυπων bam3 και bam4. Η μικροσκοπική παρατήρηση σε φύλλα και κοτηλιδόνες των μολυσμένων με τον ωομύκητα φυτών μετά από χρώση Trypan Blue, έδειξε μειωμένη εξάπλωση των υφών στα μολυσμένα φύλλα των φυτών bam3, ενώ ο γονότυπος bam4 δεν διαφοροποιήθηκε ιδιαίτερα σε σχέση με τους νονότυπους Col-0, baml και bam2, ως προς την εξάπλωση του ωομύκητα στους μεσοκυττάριους χώρους των προσβεβλημένων φύλλων. Στα πειράματα παθογένειας των υπό εξέταση γονότυπων με το βακτήριο Pst DC3000, τα αποτελέσματα τόσο του νωπού βάρους των φυτών για κάθε γονότυπο, όσο και η ποσοτικοποίηση του ενδοφυτικού πληθυσμού του βακτηρίου στα προσβεβλημένα από το βακτήριο φύλλα για κάθε γονότυπο κατέδειξαν την αυξημένη ανθεκτικότητα του γονότυπου bam3. Στην αλληλεπίδραση των υπό εξέταση γονότυπων με το μύκητα Β. cinerea, οι γονότυποι δεν διαφοροποιήθηκαν στατιστικά σημαντικά μεταξύ τους ως προς τη συχνότητα εμφάνισης και τη μέση διάμετρο των νεκρωτικών κηλίδων στα φύλλα. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της ποσοτικοποίησης των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων PR1 και PDF1.2 με τη μέθοδο Real Time qPCR, η ανθεκτικότητα των γονότυπων bam3 και bam4 στην αλληλεπίδραση των φυτών με τον ωομύκητα Η. arabidopsidis και του bam3 στην αλληλεπίδραση των φυτών με το βακτήριο Pst DC3000 ευθύνεται σε ένα βαθμό στην υπερέκφραση του γονιδίου PR1, το οποίο σχετίζεται με την επαγόμενη από το σαλικυλικό οξύ διασυστηματική άμυνα των φυτών. Η παρουσία των παθογόνων Η. arabidopsidis και Pst DC3000 είχε ως αποτέλεσμα την υπερέκφραση του γονιδίου ΒΑΜ3 στα φυτά αγρίου τύπου κατά τα πρώτα στάδια της μόλυνσης. Συμπερασματικά, η απόκριση των φυτών σε προσβολές από παθογόνα αίτια, πιθανόν να συνδέεται με τις μεταβολές των ενδογενών επιπέδων των υδατανθράκων. Αφενός, τα διαφορετικά ενδογενή επίπεδα υδατανθράκων πιθανόν να σχετίζονται με τη ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων που εμπλέκονται στην επαγόμενη διασυστηματική άμυνα των φυτών και αφετέρου τα παθογόνα μεταβάλλοντας τα επίπεδα υδατανθράκων προσανατολίζουν το μεταβολισμό των φυτών ως προς το όφελος τους.

Little is known about the role of plant primary metabolism in defense against pathogens. The regulatory role of primary metabolism products in triggered immunity of plants seems to be specific to different pathogen lifestyles. In the present study, we investigated the contribution of b-amylase genes (BAMs) in plant resistance against biotrophic, hemibiotrophic and necrotrophic pathogens. More particularly, we examined the response of Arabidopsis thaliana plants impaired in BAM1, BAM2, BAM3, BAM4 genes mutants against the biotrophic pathogen Hyaloperonospora arabidopsidis, the hemibiotrophic Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000) and the necrotrophic Botrytis cinerea. In the interaction of host plants (bam1, bam2, bam3, bam4 and Col-0) with the biotrophic pathogen H. arabidopsidis, we observed increased resistance of bam3 and bam4 plants against H. arabidopsidis compared to the plants Col-0, bam1 and bam2. The number of spores of oomycetes in bam3 and bam4 plants was significantly decreased compared to bam1, bam2 and wild type plants. The Trypan Blue Staining in leaves and cotyledons of infected with H. arabidopsidis plants showed decreased development of hyphae of oomycetes in the leaves of bam3 plants compared to the rest of examined genotypes. In the interaction of host plant with the pathogen Pst DC3000, we observed decreased severity of the disease in bam3 plants, compared to the rest of examined genotypes, which were susceptible to the disease. The fresh weight of bam3 plants after the inoculation of pathogen was not changed significantly compared to the fresh weight of untreated plants. Similarly, the density of bacteria (cfu/gr of fresh tissue) in bam3 plants was decreased significantly compared to the rest of examined plants. In the interaction of host plants with the necrotrophic fungi B. cinerea, we did not observe any significant diversion in the severity of the disease between the examined plants. The up-regulated levels of expression of the PR1 gene in bam3 and bam4 plants after the inoculation of H. arabidopsidis and Pst DC3000 led us to correlate the increased resistance of the plants bam3 and bam4 against the biotrophic and hemibiotrophic pathogens with the salicilic acid triggered immunity, which is responsible for the resistance of plants against biotrophic pathogens. The BAM1 and BAM3 expression was altered significantly upon the H. arabidopsidis and Pst DC3000 infection in the wild type plants. More particularly the BAM3 gene was up-regulated in the wild type plants during the primary stages of infection, whereas the BAM1 gene was up-regulated during the later stages of infection in the interaction of wild type plants with oomycetes