Study of lipid production by the Zygomycete Mortierella isabellina during growth on blends of cellulosic sugars

Abstract

Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνηθεί η βιοφυσιολογική συμπεριφορά του ελαιογόνου μύκητα Mortierella isabellina (ATHUM 2935) καθώς και η ικανότητα του να συσσωρεύει λίπος πλούσιο σε πολυακόρεστα λιπαρά οξέα (PUFAs) και ιδίως γ-λινολενικό οξύ. Η καλλιέργεια του μύκητα πραγματοποιήθηκε σε σακχαρούχα ανανεώσιμα υποστρώματα, τα οποία αποτελούν προϊόντα υδρόλυσης των λιγνοκυτταρινούχων υπολειμμάτων. Συγκεκριμένα, τα θρεπτικά υποστρώματα που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη ήταν η γλυκόζη, η ξυλόζη καθώς και μείγματα αυτών σε αρχικές συγκεντρώσεις των 80 g/L. Όλες οι ζυμώσεις πραγματοποιήθηκαν σε καλλιέργειες κλειστού τύπου και η βιοχημική συμπεριφορά ( παραγωγή βιομάζας, συσσώρευση των συνολικών λιπιδίων, πρόσληψη υποστρώματος και σύνθεση των λιπαρών οξέων) μελετήθηκε όταν ο μικροοργανισμός καλλιεργήθηκε υπό περιοριστικές σε άζωτο συνθήκες, προκειμένου να ευνοηθεί η λιποσυσσώρευση (ο λόγος C / N σε κάθε περίπτωση ήταν ίσος με 204). Κατά την διεξαγωγή των πειραμάτων, ο μύκητας παρουσίασε σημαντική κυτταρική αύξηση σε όλα τα υποστρώματα καθώς και σημαντική παραγωγή μικροβιακού λίπους. Οι διαφορές που παρατηρήθηκαν στη διαδικασία της λιποσυσσώρευσης, σχετίζονται κατά βάση με τις πηγές άνθρακα που χρησιμοποιήθηκαν και αποδίδονται στις διαφορετικές μεταβολικές οδούς που εμπλέκονται στην αφομοίωση των διαφορετικών υποστρωμάτων. Συγκεκριμένα, στην περίπτωση που χρησιμοποιήθηκε ως μόνη πηγή άνθρακα η γλυκόζη (80 g / L) , ο Mortierella isabellina παρήγαγε 28 g / L βιομάζας μετά από 332 ώρες καλλιέργειας, ενώ 13,6 g / L λιπιδίων παρήχθησαν μετά από 499h καλλιέργειας. Η αντίστοιχη περιεκτικότητα λίπους στην ξηρά βιομάζας σε αυτό το σημείο (YL / X) ήταν ίση με 51,1% (w / w). Αντίθετα, όταν ως μοναδική πηγή άνθρακα χρησιμοποιήθηκε η ξυλόζη (80 g / L), ο μύκητας εμφάνισε μικρότερη κυτταρική αύξηση (20.7 g / L) και λιποσυσσώρευση (7,71 g / L) στις 332 ώρες καλλιέργειας. Ωστόσο, στα μίγματα γλυκόζης- ξυλόζης, τόσο η ανάπτυξη του στελέχους όσο και η παραγωγή λίπους πλούσιου σε GLA ήταν αξιοσημείωτη. Η μέγιστη παραγωγή βιομάζας στα μίγματα κυμάνθηκε από 20.5 έως 27.9 g / L. Πιο συγκεκριμένα , ο Mortierella isabellina ATHUM 2935 αυξήθηκε σημαντικά στο μείγμα γλυκόζη-ξυλόζη 60:20 (g / L) παράγοντας μέγιστη βιομάζα η οποία έφτασε τα 27,9 g / L με ταυτόχρονη παραγωγή λίπους 12,8 g / L. Στο συγκεκριμένο πείραμα, επιτεύχθηκε και η υψηλότερη παραγωγή λίπους (15,59 g / L) μετά 280 ώρες καλλιέργειας. Όσον αφορά την παραγωγή GLA στο μείγμα γλυκόζης: ξυλόζη 60:20 (σε g / L) έφτασε την μέγιστη τιμή των 520 mg / L περίπου 280 ώρες μετά τον εμβολιασμό, αποδεικνύοντας ότι το συγκεκριμένο υπόστρωμα είναι το πιο υποσχόμενο μεταξύ των άλλων που χρησιμοποιήθηκαν για τη συσσώρευση του προαναφερθέντος λιπαρού οξέος. Ικανοποιητικά ήταν τα αποτελέσματα από την καλλιέργεια του μικροοργανισμού σε μείγμα γλυκόζης-ξυλόζη (40:40 g / L), όπου η παραγόμενη βιομάζα ανήλθε στα 23,0 g / L, με ταυτόχρονη παραγωγή λίπους 8,7 g / L. Επιπλέον, το μείγμα ξυλόζης - γλυκόζης (60:20 g / L) αποδείχτηκε αρκετά ικανοποιητικό υπόστρωμα για τον μύκητα Mortierella isabellina παράγοντας μέγιστη ποσότητα βιομάζας ίση με 20,5 g / L καθώς και λίπους ίση με 12,3 g / L. Αξίζει να σημειωθεί ότι ,στα θρεπτικά υποστρώματα που περιείχαν ξυλόζη είτε ως μόνη πηγή άνθρακα είτε σαν μείγμα (80 g / L και 60:20 g / L), παρατηρήθηκε παραγωγή ξυλιτόλης, η ποσότητα της οποίας έφτασε τη μέγιστη τιμή 23,5 g / L όταν η ξυλόζη χρησιμοποιήθηκε ως μοναδική πηγή άνθρακα. Από την ανάλυση των ενδοκυτταρικών λιπιδίων του μικροοργανισμού, προκύπτει ότι το ελαϊκό οξύ ήταν το κυρίαρχο οξύ, με ποσοστά που κυμάνθηκαν από 33 έως 55% του συνόλου των λιπαρών οξέων, ενώ ο μικροοργανισμός εμφάνισε ικανοποιητική δυνατότητα παραγωγής γ-λινολενικού οξέος(GLA), ανεξαρτήτως της εκάστοτε πηγής άνθρακα που χρησιμοποιείται. Επίσης το GLA υπήρξε παρόν σε όλα τα στάδια ανάπτυξης στο ενδοκυτταρικό λίπος, με ποσοστά τα οποία κυμάνθηκαν από 0,73 έως 5,41% w/w. Επιπλέον, η ανάλυση στα κλάσματα των ολικών λιπιδίων του μύκητα αποκάλυψε ότι τα ουδέτερα λιπίδια αποτελούν το μεγαλύτερο ποσοστό έναντι των πολικών λιπιδίων (G + S, P). Επιπρόσθετα, η εκτίμηση της συνολικής ποσότητας των φωσφολιπιδίων μέσω του προσδιορισμού του φωσφόρου απέδειξε ότι υπάρχουν αξιοσημείωτες διαφορές μεταξύ του περιεχομένου των φωσφολιπιδίων η οποία επηρεάζεται όχι μόνο από τη διάρκεια της εκάστοτε ζύμωσης αλλά και από το υπόστρωμα που χρησιμοποιείται. Η ανάλυση της συνολικής περιεκτικότητας σε σάκχαρα τα οποία περιέχονται κυρίως στα κλάσματα των γλυκολιπιδίων και σφιγγολιπιδίων του μύκητα έδειξε δεν ήταν σταθερή δεδομένου ότι αντικατοπτρίζει τη διακύμανση της βιοσύνθεσης αυτών κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του μύκητα. Τέλος, η περαιτέρω ανάλυση στο λίπος μέσω χρωματογραφίας λεπτής στοιβάδας (TLC) έδειξε ότι τα μη-πολικά λιπίδια που περιέχονται στο λίπος του μύκητα αποτελούνται κυρίως από τριγλυκερίδια (TAG) και σε μικρότερο βαθμό απο εστέρες στερολών (CE), ελεύθερα λιπαρά οξέα (FFA), στερόλες (CL) και μονογλυκερίδια (MAG) ενώ στα πολικά λιπίδια ταυτοποιήθηκαν η φωσφατιδυλο-χολίνη (PC), η μονογαλακτοσυλοδιακυλογλυκερόλη (MGDG) καθώς και οι κερεβροζίτες.

Aim of the present study was to investigate the potential of growth and lipid production by an oleaginous fungus (Zygomycetes strain) namely, Mortierella isabellina (ATHUM 2935), to accumulate Single Cell Oil (SCO) rich in Polusatturated Fatty Acids (PUFAs), especially, γ- linolenic acid (GLA), an unsaturated fatty acid of nutritional and medical importance. The aforementioned microorganism was cultivated on sugar-based renewable carbon sources, that are the main products from hydrolysis of lignocellulosic residues. Particularly, the substrates used were glucose and xylose, either as sole carbon source or as blends in various ratio at initial total sugar concentration of 80 g/L. Experiments were conducted in shake-flasks and the biochemical behavior (biomass production, accumulation of total lipid, substrate uptake, fatty acid composition of fungal oil) was studied when the microorganism was cultivated under nitrogen limited conditions, in order to direct the microbial metabolism towards the synthesis of intra-cellular lipid (initial molar C/N equal to 204). The microorganism presented notable growth in all substrates, while lipid accumulation was overall satisfactory. The differences observed in the process of lipid accumulation as related to the carbon sources used for Mortierella isabellina were attributed to the different metabolic pathways involved in the assimilation of the different substrates. Therefore, the various carbon sources/mixtures were channeled, at different extent, to storage lipid or to lipid-free biomass formation. Specifically, in the case of glucose used as sole carbon source (80 g/L) Mortierella isabellina produced 28 g/L biomass after 332 h of cultivation while 13.6 g/L lipid were produced after 499h of cultivation. The corresponding lipid in total dry biomass at this point (YL/X) was equal to 51.1 % (w/w). On the contrary, when xylose was used as sole carbon source (80 g/L) lower final concentrations as far as both growth (20.7 g/L biomass) and lipid accumulation (7.71 g/L) were concerned after 332h. However, the growth of the strain was notable with simultaneous production of noticeable amounts of lipids, also rich in GLA, in all glucose-xylose blends with maximum biomass production ranging from 20.5 to 27.9 g /L. Especially, Mortierella isabellina strain ATHUM 2935 grew remarkably on glucose-xylose blend 60:20 (g/L) and produced 27.9 g/L biomass with a lipid content of 12.8 g/L at this point. In this trial, the overall highest lipid production was achieved (15.59 g/L) after 280h of cultivation. As far as GLA production was concerned, the mixture of glucose: xylose 60:20 (in g /L) proved to be the most promising substrate among others tested for the accumulation of the aforementioned FA, reaching the maximum value of 520 mg /L about 280 h after inoculation. Satisfactory results were shown from the cultivation of the microorganism on the glucose-xylose blend (40:40 g/L), where the produced biomass value was 23.0 g/L, containing 8.7 g/L of lipid. Furthermore, the xylose - glucose mixture (60:20 g/L) was proven to be an adequate substrate for Mortierella isabellina by producing fair amounts of biomass (20.5 g/L) with notable lipid content (12.3 g/L). Moreover, substrates containing xylose either as the sole carbon source or as a mixture (80 g/L and 60:20 g/L), induced the production of xylitol, reaching a highest value of 23.5 g/L in trials with xylose employed as sole carbon source. Analysis of intra-cellular lipid showed that the most predominant component in the mycelium was oleic acid in the range of 33-55% of the total fatty acids while 7 the microorganism showed satisfactory capability to produce γ-linolenic acid (GLA), regardless of the substrate employed. GLA (C18:3n- 6) was present in all growth steps in the reserve cellular lipids, in concentrations between 0.73 – 5.41 % w/w. Furthermore, fraction analysis of total lipids revealed that mycelia contained higher amounts of neutral lipids (N) than polar lipids (G+S, P). Additionally, the estimation of the total amount of phospholipids through the phosphorus determination revealed notable differences between the phospholipid content which was affected not only by the duration of the particular fermentation but also from the substrate used. Moreover, the analysis of the total sugar content in lipid samples showed that the sugar content, contained at glycolipid and sphingolipid fractions was not constant since it reflects the biosynthesis variation of these lipid classes during the fermentations. Last but not least, further analysis via thin layer -chromatography (TLC) on silica gel G was conducted to determine the relative composition of the major lipid classes of the aforementioned microorganism. The non-polar lipids identified were: predominantly triacylglycerols (TAG) and to a lesser degree sterol esters (CE), free fatty acids (FFA), sterols (CL) and monoacylglycerols (MAG). Additionally, the following polar lipids were also identified: phosphatidyl-choline (PC), monogalactosyldiacylglycerol (MGDG) and cerebrosides.