Μελέτη της παραγωγής λιπιδίων και λοιπών προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας κατά την ανάπτυξη του μύκητα Thamnidium elegans CCF-1465 σε ανανεώσιμα υποστρώματα χαμηλού κόστους

Abstract

Η παρούσα ερευνητική μελέτη έχει στόχο τη διερεύνηση της βιοφυσιολογικής και της βιοχημικής συμπεριφοράς του Ζυγομύκητα Thamnidium elegans CCF-1465 και συγκεκριμένα της ικανότητας του να συσσωρεύει ενδοκυτταρικό λίπος πλούσιο σε γ-λινολενικό οξυ (GLA), ένα λιπαρό οξύ με σημαντικές διατροφικές και θεραπευτικές ιδιότητες. Συγκεκριμένα μελετήθηκε η ικανότητα παραγωγής μικροβιακής μάζας, βιοσύνθεσης ενδοκυτταρικού λίπους καθώς και η διερεύνηση της σύστασης των μικροβιακών λιπιδίων, η ανάλυση του ενδοκυτταρικού λίπους σε επιμέρους κλάσματα, ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης και του είδους των ενδοπολυσακχαριτών, η μέτρηση της ενεργότητας της εξωκυτταρικής ιμβερτάσης και ο προσδιορισμός του βαθμού αποχρωματισμού του αποβλήτου ή του συνδυασμού αυτών, κατά την καλλιέργεια του μύκητα σε ανανεώσιμες πηγές ενέργειας. Συγκεκριμένα, τα θρεπτικά μέσα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν η μελάσα (αποβλήτο της βιομηχανίας ζάχαρης), η εμπορική σακχαρόζη και η ακάθαρτη γλυκερόλη. Αρχικά πραγματοποιήθηκαν ζυμώσεις βυθού με τις εξής αρχικές συγκεντρώσεις ολικών σακχάρων (ΤS0) ως πηγής άνθρακα: 50 g/L, 80 g/L, 100 g/L και 120 g/L μελάσας και 50 g/L σουκρόζης. Προκειμένου να ανέλθει ο λόγος C/N σε υψηλότερα επίπεδα για να ευνοηθεί η συσσώρευση ενδοκυτταρικού λίπους πραγματοποιήθηκαν ζυμώσεις με συνδυασμό ΤS0: 50 g/L μελάσας : 40 g/L ακάθαρτης γλυκερόλης. Κατά τη διεξαγωγή της πειραματικής διαδικασίας, ο μύκητας παρουσίασε σημαντική κυτταρική αύξηση σε όλα τα υποστρώματα, καθώς και ικανοποιητική παραγωγή μικροβιακού λίπους, πλούσιο σε GLA, σε ορισμένα από αυτά. Συγκεκριμένα, στο μέσο με ΤS0: 50 g/L μελάσας και 40 g/L γλυκερόλης, ο μύκητας παρήγαγε 29,4 g/L βιομάζας και 13,3 g/L ενδοκυτταρικού λίπους με περιεκτικότητα σε GLA που έφτασε τα 998 mg/L. Παρόμοια αποτελέσματα σημειώθηκαν κατά την καλλιέργεια του μύκητα στο υπόστρωμα μελάσας με αρχική συγκέντρωση σακχάρων 80 g/L, με παραγωγή βιομάζας 31,9 g/L, ενδοκυτταρικό λίπος 11,6 g/L και 766 mg/L GLA. Αντίθετα, στα υποστρώματα με βάση τη μελάσα ως μόνη πηγή άνθρακα (με αρχική συγκέντρωση σακχάρων 50, 100, 120 g/L, ο μύκητας εμφάνισε παρόμοια κυτταρική αύξηση (21,8-31,3 g/L) αλλά παρήγαγε χαμηλότερα ποσά λίπους (3,3 - 4,4 g/L) με χαμηλότερες συγκεντρώσεις GLA αντίστοιχα. Ωστόσο, στο υπόστρωμα με βάση την σακχαρόζη ως μόνη πηγή άνθρακα, ο μύκητας αναπτύχθηκε ικανοποιητικά και παρήγαγε σημαντικές ποσότητες ενδοκυτταρικού λίπους με σημαντική περιεκτικότητα σε GLA, συγκεκριμένα παρήγαγε 19,6 g/L βιομάζας, 7,7 g/L ενδοκυτταρικού λίπους και 440 mg/L GLA. Η εξέλιξη της κατανάλωσης της πηγής άνθρακα και της πρωτεΐνης του υποστρώματος καταγράφηκε σε όλα τα θρεπτικά μέσα ανάπτυξης αλλά δεν παρατηρήθηκε πλήρης εξάντλησή τους σε όλες τις περιπτώσεις. Αξίζει να σημειωθεί ότι σε όλα τα θρεπτικά υποστρώματα ο μύκητας εμφάνισε ικανοποιητικά αποτελέσματα όσον αφορά στη συσσώρευση ενδοπολυσακχαριτών περί των 2,4-7,4 g/L με μέγιστη συγκέντρωση συσσώρευσης ενδοπολυσακχαριτών στο υπόστρωμα μελάσας με αρχική συγκέντρωση σακχάρων 100 g/L όπου δεν παρατηρήθηκε σημαντική παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους περί των 4,0 g/L. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε ανάλυση της σύστασης του ενδοκυτταρικού λίπους σε λιπαρά οξέα. Από τις αναλύσεις αυτές στην πλειοψηφία των δειγμάτων προκύπτει ότι τα μεγαλύτερα ποσοστά (%) γ-λινολενικού οξέος (GLA) επί των ολικών λιπαρών οξέων σημειώνονται κατά την αρχή της ζύμωσης όταν η παραγωγή του ενδοκυτταρικού λίπους είναι χαμηλή. Το επικρατέστερο λιπαρό οξύ επί των ολικών λιπαρών οξέων ήταν το ελαϊκό οξύ (C18:1) με ποσοστά που κυμαίνονταν μεταξύ 18–51% και ακολούθησε το παλμιτικό (C16:0) και το λινελαϊκό οξύ (C18:2), τα οποία απαντώνταν επίσης σε σημαντικές ποσότητες. Επιπλέον, κατά την κλασμάτωση των λιπιδίων παρατηρήθηκε ότι τα ουδέτερα λιπίδια (Ν) αποτελούν το μεγαλύτερο ποσοστό των ολικών λιπιδίων (TL) και ακολουθούν τα σφιγγο-γλυκολιπίδια (S-G) και τα φωσφολιπίδια (Ρ) με χαμηλότερα ποσοστά. Ακόμη στα μέσα αύξησης με τη μελάσα ως μόνη πηγή άνθρακα σημειώθηκε αποχρωματισμός 37,2-69,0 % ενώ κατά την καλλιέργεια του μύκητα σε υπόστρωμα μελάσας-γλυκερόλης σημειώθηκε αποχρωματισμός περί του 33%. Ολοκληρώνοντας πραγματοποιήθηκε η μέτρηση της ενεργότητας της εξωκυτταρικής ιμβερτάσης σε όλες τις βιομετατροπές όπου η μέγιστη ενεργότητα ήταν 0,32 U/mL κατά την καλλιέργεια του μύκητα σε υπόστρωμα μελάσας, αρχικής συγκέντρωσης σακχάρων 100 g/L.

The aim of the present study was to investigate the biochemical behavior and ability of a Zygomycetes strain, namely Thamnidium elegans CCF-1465, to accumulate single cell oil (SCO) rich in γ-linolenic acid (GLA), an unsaturated fatty acid of nutritional and medical importance. Specifically, the capacity of the strain to produce microbial mass, the biosynthesis of intracellular oil and the investigation of the composition of the total microbial lipids and their fractions, the determination of the intracellular polysaccharides (IPS), the activity of extracellular invertase and the decolorization of the waste or their combination were studied. The substrates used were molasses (waste from sugar industry), commercial sucrose and raw glycerol. Experiments were conducted in shake-flasks with the following initial total sugars concentrations (ΤS0) as carbon source: 50 g/L, 80 g/L, 100 g/L and 120 g/L molasses and 50 g/L sucrose. In order to reach the ratio C/N at higher levels to promote single cell oil accumulation a bioconversion with substrate the combining of ΤS0:50 g/L molasses : 40 g/L glycerol was performed. The strain presented significant cell growth in every substrates, and in some of them, lipid accumulation was satisfactory. Specifically, the strain produced 29.4 g/L biomass and 13.3 g/L SCO and with significant high GLA content (998 mg/L), when was cultivated on ΤS0:50 g/L of molasses and 40 g/L glycerol. Similar results were achieved during the culture of the strain in molasses substrate with initial sugar concentration 80g / L, with biomass 31,9 g/L, SCO at 11.6 g/L and 766 mg/L GLA. Conversely, substrates based on molasses as unique carbon source (with initial sugar concentration 50, 100, 120 g/L, the strain showed similar cell growth (21,8-31,3 g/L) but lower amounts of SCO (3,3-4,4 g/L) and lower amounts of GLA were produced. However, when cultivated on substrate based on sucrose, as unique carbon source, the strain grew well and produced significant quantities of SCO with significant GLA content, in particular 19.6 g/L biomass, 7.7 g/L SCO and 440 mg/L GLA were produced. Furthermore, the progress of the consumption of carbon source and the protein from substrate were recorded in all growth media, but full depletion was not observed in all cases. Notably, the strain showed satisfactory results in accumulating intracellular polysaccharides from 2,4 to 7,4 g/L in all substrates with maximum accumulation in molasses , with initial sugar concentration 100 g/L, but no significant production of SCO was observed (4,0 g/L). Moreover, analyzing the composition of SCO into fatty acids, the majority of the samples showed that percentage (%) of γ- linolenic acid (GLA) on total fatty acids content was higher in the beginning of the fermentation when production of SCO was lower. In all experiments the predominant fatty acid of total fatty acids was oleic acid (C18: 1) that ranged between 18 to 51% followed by palmitic (C16: 0) and linoleic acid (C18: 2), which also were in significant quantities. Furthermore, during the fractionation of lipids was observed that the neutral lipids (N) constituted the largest percentage of total lipids (TL) followed by sphingo-glycolipids (S-G) and phospholipids (P) in lower rates. Additionally, in all substrates with molasses as the sole carbon source, the decolorization was around 37.2 - 69,0 % while in the cultivation of the strain in molasses-glycerol substrate was 33%. Finally, the determination of the extracellular invertase activity was performed. Results showed that maximum extracellular invertase activity was 0.32 U/mL during the cultivation of the strain on molasses medium, with initial concentration of sugars 100 g/L.