Επιλογή στελεχών ζυμών προς βιοτεχνολογική παραγωγή δευτερογενών μεταβολιτών και λιπιδίων χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα την ακάθαρτη βιομηχανική γλυκερόλη

Abstract

Σκοπός της παρούσας μελέτη ήταν η διερεύνηση της ικανότητας ανάπτυξης διάφορων στελεχών ζυμών χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα ανανεώσιμες πρώτες ύλες, συγκεκριμένα ακάθαρτη βιομηχανική γλυκερόλη, η οποία είναι παραπροϊόν της βιομηχανικής παραγωγής βιοκαυσίμου (biodiesel). Ειδικότερα, μελετήθηκε η ικανότητα των ζυμών να μεταβολίζουν την ακάθαρτη βιομηχανική γλυκερόλη προς παραγωγή βιομάζας, δευτερογενών μεταβολιτών (μικροβιακού λίπους και ενδοπολυσακχαριτών) και διαφόρων μεταβολικών προϊόντων (π.χ. αραβιτόλη, μαννιτόλη) των στελεχών αυτών. Οι καλλιέργειες διενεργήθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις υποστρώματος, σε σταθερές συνθήκες ανάδευσης και θερμοκρασίας. Τα στελέχη των ζυμών που χρησιμοποιήθηκαν ανήκουν στα γένη Yarrowia, Cryptococcus, Debaryomyces, Rhodotorula, Rhodosporidium και τρία μη ταυτοποιημένα στελέχη του γένους Metschnikowia, που απομονώθηκαν από τα είδη Prunus domestica (κορομηλιά) και Vitis vinifera (άμπελος). Η γλυκερόλη που χρησιμοποιήθηκε ήταν διαχωρισμένη και καθαρότητας 95% κατά βάρος. Η παρούσα μελέτη χωρίστηκε σε τέσσερα πειραματικά στάδια, στα τρία πρώτα οι καλλιέργειες διενεργήθηκαν σε κωνικές φιάλες των 250 mL και το τέταρτο σε βιοαντιδραστήρα κλειστού τύπου (batch bioreactor) των 3 L. Στο πρώτο πείραμα μελετήθηκε το σύνολο των στελεχών σε υγρές καλλιέργειες με υπόστρωμα βιομηχανικής γλυκερόλης, συγκέντρωσης 40 g/L. Η συγκριτική τους αξιολόγηση βασίστηκε στην ικανότητά τους να αξιοποιούν την γλυκερόλη καταναλώνοντας και μετατρέποντάς την σε βιομάζα, λιπίδια, ενδοπολυσακχαρίτες και δευτερογενείς μεταβολίτες. Οι μετρήσεις έδειξαν ότι οι περισσότεροι μικροοργανισμοί προσαρμόστηκαν στο υπόστρωμα της γλυκερόλης παράγοντας ικανοποιητικές ποσότητες βιομάζας και ενδοπολυσακχαριτών, ενώ από στελέχη των γενών Yarrowia lipolytica LMBF Y-45, LMBF Y-46, LMBF Y-47 και Debaryomyces hansenii EMBT Y-41 παρατηρήθηκε παραγωγή πολυολών και παραγωγή ενδοκυτταρικών λιπιδίων σε ικανοποιητικές ποσότητες για περαιτέρω διερεύνηση παρατηρήθηκε από τα στελέχη Rhodotorula glutinis NRRL YB-252 και Cryptococcus curvatus NRRL Y-1511. Στο δεύτερο πείραμα μελετήθηκαν περαιτέρω πέντε επιλεγμένα στελέχη σε υγρές καλλιέργειες με υπόστρωμα βιομηχανικής γλυκερόλης, συγκέντρωσης 80 g/L. Παρατηρήθηκαν, υψηλή παραγωγή σε αραβιτόλη από το στέλεχος και Debaryomyces hansenii EMBT Y-41 με μέγιστη τιμή τα 27.5 g/L στις 240 h και σε ενδοκυτταρικά λιπίδια από το στέλεχος Rhodotorula glutinis NRRL YB-252 με μέγιστη τιμή τα 7.2 g/L στις 216 h. Στο τρίτο πείραμα μελετήθηκε το στέλεχος Debaryomyces hansenii EMBT Y-41 σε υγρή καλλιέργεια με υπόστρωμα βιομηχανικής γλυκερόλης, συγκέντρωσης 125 g/L. Παρατηρήθηκε ακόμη μεγαλύτερη παραγωγή αραβιτόλης, 47.5 g/L στις 360 h με συντελεστή απόδοσης επί του καταναλωθέντος υποστρώματος Yarol/S=0.62 g/g. Η τιμή αυτή είναι, επί του παρόντος, η μεγαλύτερη τιμή που έχει αναφερθεί σε αντίστοιχες δημοσιευμένες έγκριτες μελέτες που αφορούν στην παραγωγή αραβιτόλης με υπόστρωμα ανάπτυξης μικροοργανισμού την γλυκερόλη. Στο τέταρτο πείραμα μελετήθηκε, σε βιοαντιδραστήρα, το στέλεχος Debaryomyces hansenii EMBT Y-41 σε υγρή καλλιέργεια με υπόστρωμα βιομηχανικής γλυκερόλης, συγκέντρωσης 80 g/L. Παρατηρήθηκε μέγιστη παραγωγή αραβιτόλης, 27.8 g/L στις 72 h, καθώς και βιομάζας, 33.1 g/L στις 104 h, σε πιο σύντομο χρονικό διάστημα σε σύγκριση με τις καλλιέργειες στις κωνικές φιάλες.

The purpose of this study was to investigate the ability of various yeast strains to grow on renewable raw materials, particularly crude-industrial glycerol, which is the main byproduct of the industrial production of biodiesel. In particular, the ability of yeasts to metabolize industrial crude glycerol to produce biomass, secondary metabolites (single cell oil and intra-cellular polysaccharides) and various metabolic products (e.g., arabitol, mannitol) was studied. Fermentations were performed at different substrate concentrations at constant stirring and temperature. The yeast strains which were used belong to the genera Yarrowia, Cryptococcus, Debaryomyces, Rhodotorula, Rhodosporidium and furthermore three unidentified strains, isolated from the species Prunus domestica (plum) and Vitis vinifera (grape vine). The glycerol used was separated and 95% purity w/w. This study was divided into four experimental stages, the first three experiments were conducted in Erlenmeyer flasks 250 mL and fourth in a 3 L batch bioreactor. In the first experiment all yeast strains were cultivated in liquid submerged culture with 40 g/L initial glycerol as substrate (shake-flasks). The comparative assessment (screening) was based on their ability to utilize glycerol consuming and turning it into biomass, lipids, intra-cellular polysaccharides and secondary metabolites. The results showed that most strains were adapted to the glycerol-composed media producing sufficient quantities of biomass and intra-cellular polysaccharides, while the yeast strains Yarrowia lipolytica LMBF Y-45, LMBF Y-46, LMBF Y-47 and Debaryomyces hansenii EMBT Y-41 produced polyols (sugar alcohols). Also, the yeast strains Rhodotorula glutinis NRRL YB-252 and Cryptococcus curvatus NRRL Y-1511 produced sufficient quantities of intracellular lipids, fact that deserves further investigation. In the second experiment five selected yeast strains were studied further in liquid submerged shake-flask cultures with 80 g/L initial glycerol as substrate. High arabitol production was observed by the strain Debaryomyces hansenii EMBT Y-41 and a maximum quantity was achieved of 27.5 g/L (240 h). Also, high quantities of intracellular lipids were observed by the strain Rhodotorula glutinis NRRL YB-252 and a maximum quantity was achieved of 7.2 g/L (lipid in dry weight of biomass) at 216 h. In a third experiment, a single liquid state culture was conducted with 125 g/L initial glycerol as substrate, for the strain Debaryomyces hansenii EMBT Y-41. Which resulted to a even greater production of arabitol, 47.5 g/L (360h) with a yield at 62% of the consumed glycerol-composed substrate. This value is, currently, the largest value that has been reported in relevant published reputable studies involving the production of arabitol from glycerol. The fourth experiment was conducted in a batch bioreactor for the strain Debaryomyces hansenii EMBT Y-41 in a liquid state culture, with 80 g/L initial glycerol as substrate. Which resulted to a maximum production of arabitol, 27.8 g/L (72 h) and biomass, 33.1 g/L (72 h), in a shorter time period in comparison with the cultures in Erlenmeyer flasks.