Έκφραση γονιδίων παθογένειας του τροφιμογενούς παθογόνου μικροοργανισμού Listeria monocytogenes σε συνθήκες προσομοίωσης εσωτερικού περιβάλλοντος του πεπτικού σωλήνα

Abstract

Σκοπός της παρούσας μεταπτυχιακής μελέτης ήταν ο προσδιορισμός της έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται με την παθογένεια του τροφιμογενούς παθογόνου βακτηρίου Listeria monocytogenes, έπειτα από έκθεση του μικροοργανισμού σε ανθρώπινο γαστρικό και δωδεκαδακτυλικό υγρό. Για τη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν καλλιέργειες του στελέχους R.9.1 του παθογόνου που είχαν απομονωθεί από δείγματα φράουλας. Τα γονίδια παθογένειας που μελετήθηκαν στην παρούσα εργασία είναι τα : sigB, plcA, plcB, hlyA, inlA, inlB, inlC, inlJ, lmo2672 και lmo2470. Οι λήψεις των υγρών πραγματοποιούνταν με το πέρας διαγνωστικής ενδοσκόπησης, τα υγρά τοποθετούνταν σε έτερα αποστειρωμένα δοχεία και μεταφέρονταν άμεσα και υπό ψύξη στον εργαστηριακό χώρο για την διεξαγωγή των πειραματικών διαδικασιών. Οι δειγματοληψίες πραγματοποιούνταν κατά τον εμβολιασμό του γαστρικού υγρού με το βακτηριακό στέλεχος (9 log CFU/mL), μετά την επώασή του (37oC/ 100 min), κατά την επαναιώρηση του στελέχους στο δωδεκαδακτυλικό υγρό και μετά την επώαση του εμβολιασμένου δωδεκαδακτυλικού υγρού (37oC/ 2h). Μελετήθηκαν οι μεταβολές του πληθυσμού σε κάθε στάδιο δειγματοληψίας και εξετάσθηκε η έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την παθογόνο δράση μέσω της μεθόδου της Real Time PCR. Η μεταβολή του πληθυσμού του μικροοργανισμού φαίνεται να μην μπορεί να εκτιμηθεί με κλασικές μικροβιολογικές τεχνικές καθώς επηρεάζεται από το pH και την σύσταση των υγρών καθώς και από την ηλικία και το ιατρικό ιστορικό των ασθενών. Όσον αφορά στα γονίδια παθογένειας, κάποια φάνηκε να επηρεάζονται από το pH των γαστρικών υγρών και να παρουσιάζουν υποέκφραση μετά την επώασή του γαστρικού υγρού με το στέλεχος (π.χ. sigB), άλλα γονίδια παρουσίασαν μια γενική υπερέκφραση σε σχέση με αντίστοιχη έκφρασή τους έπειτα από επώαση του στελέχους σε γενικό θρεπτικό υπόστρωμα, άλλοτε μεγαλύτερη (hly, inlC) και άλλοτε μικρότερη (plcA, plcB, inlJ, lmo2470, lmo2672), ενώ άλλα γονίδια δεν φάνηκε να επηρεάζονται από την έκθεση του μικροοργανισμού στα υγρά (inlA, inlB).

The aim of this study was to determine the expression of genes associated with the pathogenicity of the bacterial foodborne pathogen Listeria monocytogenes, after the exposure of the microorganism in human gastric and duodenal fluid. Cultures of the R.9.1 strain of the pathogen, isolated from strawberry samples, were used for the study. The pathogenic genes studied in this work are: sigB, plcA, plcB, hlyA, inlA, inlB, inlC, inlJ, lmo2672 and lmo2470. The collection of fluids was held by the end of diagnostic endoscopy. The fluids were placed in separate sterile containers, and transported directly to the laboratory in refrigerated space for carrying out the experimental procedures. Samplings were made at inoculation of gastric fluid with the bacterial strain (9 log CFU / mL), after incubation (37oC / 100 min), by resuspending the strain in the duodenal fluid and after incubation of the inoculated duodenal fluid (37oC / 2h). We studied the changes in the population at each sampling step and examined the expression of genes associated with the pathogenic effects through the Real Time PCR method. The change in the microorganism population appears that can not be assessed by standard microbiological techniques as influenced by the pH, the composition of fluids, the age and the medical history of the patient. Regarding the pathogenic genes, some appear to be influenced by the pH of gastric juice and exhibit down-regulation after incubation of the gastric fluid with the stem (e.g. sigB), other genes showed a general up-regulation compared to the corresponding expression after incubation of the strain on a general nutrient medium, sometimes more (hly, inlC) and sometimes less (plcA, plcB, inlJ, lmo2470, lmo2672), while other genes did not appear to be affected by exposure of the microorganism in the fluids (inlA, inlB).