Η συμβιωτική αζωτοδέσμευση περιλαμβάνει την αλληλεπίδραση των ψυχανθών με
βακτήρια του εδάφους που ονομάζονται ριζόβια. Η αλληλεπίδραση αυτή καταλήγει στο
σχηματισμό ενός νέου φυτικού οργάνου, του φυματίου. Κατά τη διαδικασία της
αζωτοδέσμευσης συμβαίνουν πολλές αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση και στη συσσώρευση
μεταβολιτών τόσο στα ριζόβια όσο και στο φυτό-ξενιστή. Σε μια προσπάθεια να μελετηθούν
οι συνολικές αλλαγές που συμβαίνουν στο μεταβολισμό κατά την ανάπτυξη του φυματίου,
χρησιμοποιήθηκε μια πλατφόρμα βασιζόμενη στην τεχνική ποσοτικού (RT)-PCR για τη
μελέτη της μεταγραφικής ρύθμισης γονιδίων του πρωτογενούς και δευτερογενούς
μεταβολισμού του Lotus japonicus, ενώ για την ανάλυση των μεταβολιτών αναπτύχθηκε μια
πλατφόρμα βασιζόμενη στην τεχνική GC-MS. Τόσο η μεταγραφή των γονιδίων όσο και η
συσσώρευση μεταβολιτών μελετήθηκαν σε φυτά L. japonicus που είχαν υποστεί
παρατεταμένο σκοτάδι για 24 και 72 ώρες. Η έλλειψη φωτοσυνθετικού άνθρακα που
προκλήθηκε από το παρατεταμένο σκοτάδι είχε ως αποτέλεσμα αλλαγές τόσο στη
συσσώρευση των μεταγραφημάτων των γονιδίων όσο και στη συσσώρευση μεταβολιτών. Τα
μεταγραφικά επίπεδα των περισσοτέρων γονιδίων που μελετήθηκαν μειώθηκαν κατά τη
διάρκεια της σκοτεινής περιόδου, και ιδιαίτερα, μετά από 72 ώρες συνεχούς σκότους. Τα
επίπεδα των μεταβολιτών είτε ήταν μειωμένα είτε δεν παρουσίασαν διαφορά. Εξαίρεση
αποτέλεσε η μεγάλη συσσώρευση αμινοξέων, δηλώνοντας πιθανή αποδόμηση των πρωτεϊνών
στις συνθήκες αυτές. Η έλλειψη άνθρακα επηρέασε πολλές μεταβολικές διαδικασίες του
φυματίου, περιλαμβάνοντας σύνθεση αμύλου, γλυκόλυση, δέσμευση CO
και αφομοίωση
αζώτου. Η ταυτόχρονη μείωση των μεταβολικών μονοπατιών της γλυκόλυσης και της
δέσμευσης CO
είχε ως αποτέλεσμα την έλλειψη σε σκελετούς άνθρακα και ιδιαίτερα την
έλλειψη μηλικού οξέως, που θεωρείται η κύρια πηγή άνθρακα για το μεταβολισμό των
βακτηριοειδών και την αζωτοδέσμευση. Τα πολύ αυξημένα επίπεδα έκφρασης ενός γονιδίου
που κωδικοποιεί για NADH-εξαρτώμενη αφυδρογονάση του γλουταμινικού είναι πιθανό να
2
χρειάζονται για την αποδόμηση των αμινοξέων με σκοπό να παρέχονται σκελετοί άνθρακα
στην αναπνευστική οδό, λειτουργώντας ως μια εναλλακτική πηγή ενέργειας.
Ένα από τα τελικά προϊόντα του μεταβολισμού του άνθρακα είναι το CO
, το οποίο
παρουσιάζει υψηλή συσσώρευση στα φυμάτια. Η καρβονική ανυδράση (CA, EC 4.2.1.1)
αποτελεί ένζυμο-«κλειδί» στο μεταβολισμό του CO
καθώς καταλύει την αμφίδρομη
αντίδραση ενυδάτωσής του παράγοντας HCO
3
-
2
. Οι καρβονικές ανυδράσες είναι άφθονα στη
φύση ένζυμα, που βρίσκονται σε όλους τους ζωντανούς οργανισμούς και συμμετέχουν σε
πλήθος φυσιολογικών και βιοχημικών διαδικασιών. In silico ανάλυση των ESTs του L.
japonicus αποκάλυψε την ύπαρξη δύο cDNA κλώνων, που ονομάστηκαν Ljcaα1 και Ljcaα2,
2
2
και κωδικοποιούν για α-τύπου καρβονικές ανυδράσες όμοιες με τους α-τύπου ισομόρφους
των θυλαστικών. Ένα άλλο γονίδιο, το Ljca1, που κωδικοποιεί για μια β-τύπου CA
μελετήθηκε επίσης. Η λειτουργικότητα των πολυπεπτιδίων που κωδικοποιούν τα γονίδια
αυτά, επιβεβαιώθηκε με βιοχημικές δοκιμές, χρησιμοποιώντας μια μέθοδο που βασίζεται σε
μετρήσεις στην αλλαγή του pH κατά τη διάρκεια της βιοχημικής αντίδρασης με τη χρήση
μιας χρωμοφόρου ουσίας. Η έκφραση των γονιδίων μελετήθηκε με τη μέθοδο ποσοτικού
(RT)-PCR τόσο σε συμβιωτικούς όσο και σε μη συμβιωτικούς ιστούς, και βρέθηκε οτι τα
γονίδια κωδικοποιούν για ισοτύπους με ενισχυμένη έκφραση στα φυμάτια. Η έκφραση των
Ljcaα1 και Ljcaα2 ήταν μέγιστη στα αρχικά στάδια ανάπτυξης του φυματίου, ενώ στα ώριμα
φυμάτια τα επίπεδα έκφρασης μειώθηκαν. Τα μειωμένα επίπεδα έκφρασης όλων των
γονιδίων σε φυμάτια φυτών που είτε είχαν εμβολιαστεί με μεταλλαγμένα στελέχη
Mesorhizobium loti είτε είχαν υποστεί συνθήκες εκτενούς σκότους, δηλώνουν τη συσχέτιση
της έκφρασης των γονιδίων αυτών με τη λειτουργία του φυματίου και τη διαδικασία της
αζωτοδέσμευσης. Ο χωροταξικός εντοπισμός των Ljcaα1 και Ljcaα2 ελέγθηκε με RNA-RNA
in situ υβριδισμό και βρέθηκε πως και τα δύο γονίδια εντοπίζονται στα παρεγχυματικά
κύτταρα, τις ηθμαγγειώδεις δεσμίδες και τον κεντρικό ιστό. Ο φυσιολογικός ρόλος των
γονιδίων αυτών μελετήθηκε κατόπιν σίγησης των γονιδίων με τη χρήση της τεχνικής RNAi.
Η μειωμένη δραστηριότητα νιτρογενάσης στις μεταλλαγμένες σειρές φυτών που τα γονίδια
παρουσιάζουν σίγηση είναι ενδεικτική του σημαντικού ρόλου των καρβονικών ανυδρασών
στη συμβιωτική αζωτοδέσμευση
Symbiotic nitrogen fixation (SNF) involves the complex interaction of legume plants
with soil bacteria collectively called Rhizobia. This interaction results in the formation of a
novel plant organ, the root nodule. During SNF many changes occur in gene expression and
metabolite accumulation in both rhizobia and host plant. In an attempt to study global changes
occurring during nodule development, a real-time reverse transcription (RT)-PCR based
platform was developed for the transcript profiling of Lotus japonicus genes involved in
primary and secondary metabolism in nodules, while, the metabolites where analysed with the
use of a GC-MS based platform. Both gene transcript profiling and metabolite accumulation
were studied in nodules of L. japonicus plants that had undergone extended dark for 24 and
72 hours. Photosynthetic carbon deficiency caused by prolonged darkness resulted in changes
in both gene transcript level and metabolomic profile. Most genes analysed were down
regulated during the dark period and especially after 72 hours of continuous darkness.
Metabolite levels were found to be either decreased or unaltered. High accumulation of
aminoacids was an exception, denoting possible protein degradation under such conditions.
Carbon deficiency affected many metabolic processes in L. japonicus nodules, involving
starch synthesis, glycolysis, carbon fixation and ammonium assimilation. Reduced glycolysis
and carbon fixation result in deficiency of carbon skeletons and especially malate, which is
likely to be the primary source of carbon for bacteroid metabolism and SNF. The up
regulation of a gene coding for NADH-glutamate dehydrogenase is probably needed for
aminoacid breakdown to supply carbon skeletons to the respiratory pathway, as an alternative
carbon source.
, which is highly accumulating
in nodules. Carbonic Anhydrase (CA, EC 4.2.1.1) is a key enzyme in CO
One of the final products of carbon metabolism is CO
2
metabolism as it
catalyses CO
2
reversible hydration to HCO
3
-
2
. CAs are ubiquitous enzymes found in all
kingdoms of life and they are known to participate in several physiological and biochemical
processes. In silico analysis of L. japonicus ESTs revealed the existence of two cDNA clones,
designed Ljcaα1 and Ljcaα2, coding for α-type CAs similar to the mammalian α-type
isoforms. Another gene, Ljca1, coding for a β-type CA was also studied. Functionality of the
encoded polypeptides was confirmed by biochemical assays using a dye indicator method.
The temporal expression profiling of the genes was studied by real time qPCR in both
symbiotic and non-symbiotic organs and revealed that the genes code for nodule enhanced
carbonic anhydrase isoforms. Expression of both Ljcaα1 and Ljcaα2 genes was maximal at
early stages of nodule development, while at later stages the levels of both transcripts
declined. Reduced expression levels of all genes in nodules either inoculated with mutant
Mesorhizobium loti strains or after extended dark period, collerate their expression with
nodulation and nitrogen fixation. The spatial expression profiling of Ljcaα1 and Ljcaα2 genes
was examined by RNA-RNA in situ hybridization and revealed that both genes were
expressed in nodule inner cortical cells, vascular bundles, and central tissue. The
physiological role of these genes was studied by loss-of-function studies, using RNAi
mutants. The reduced nitrogenase activity in silenced mutant lines denotes the important role
of CAs in symbiotic nitrogen fixation
