Το κρέας αποτελεί πηγή ποικίλων θρεπτικών συστατικών για τον άνθρωπο αλλά
συγχρόνως είναι και εστία συγκέντρωσης μικροβιακών ομάδων. Οι ομάδες αυτές
βρίσκουν στην επιφάνεια του κρέατος τα συστατικά που ευνοούν την ανάπτυξη τους
και τη λειτουργία του μεταβολισμού τους. Ο μεταβολισμός αυτός οδηγεί σε ενδιάμεσα
και τελικά προϊόντα, τους μεταβολίτες, οι οποίοι τελικά αλλοιώνουν τα οργανοληπτικά
χαρακτηριστικά του κρέατος. Η άμεση καταγραφή και ανάλυση των μεταβολιτών
μπορεί να δώσει γρήγορα και αξιόπιστα αποτελέσματα για το επίπεδο της αλλοίωσης.
Για αυτό το λόγο τα τελευταία χρόνια έχει αναπτυχθεί ένα νέο πεδίο έρευνας τα
metabolomics το οποίο συνδυάζει διαφορετικούς κλάδους τη επιστήμης όπως η
μικροβιολογία, τα μαθηματικά και η επιστήμη των υπολογιστών με σκοπό την
ανάπτυξη μοντέλων που θα εκτιμούν ποιοτικά αλλά και ποσοτικά το μικροβιακό
πληθυσμό. Η εφαρμογή αυτών των μοντέλων μπορεί να δώσει σχετικά ακριβείς
πληροφορίες για την ποιότητα του κρέατος.
Σε αυτό το πεδίο έρευνας εφαρμόζονται αναλυτικές μέθοδοι όπως η
φασματοσκοπία και η πολυμεταβλητή στατιστική ανάλυση. Στην παρούσα εργασία
μελετήθηκαν δύο καινοτόμες τεχνικές. Η πρώτη ήταν η φασματοσκοπία υπερύθρου με
μετασχηματισμό Fourier (FTIR) και η δεύτερη η ανάλυση πολυφασματικών εικόνων (18
μήκη κύματος) που λήφθησαν από το όργανο VideometerLab. Τα δεδομένα από τις δύο
αυτές μεθόδους συνδυάστηκαν με τα δεδομένα από τη μικροβιολογική ανάλυση. Οι
μικροοργανισμοί που διαλέξαμε για να μελετήσουμε το μεταβολικό τους προφίλ ήταν η
Serratia liquefaciens και η Hafnia Alvei, δύο είδη της οικογένειας των
Enterobacteriaceae. Αυτοί οι ψυχρότροφοι, Gram αρνητικοί μικροοργανισμοί ανήκουν
στους κύριους αλλοιογόνους μικροοργανισμούς του κρέατος. Δείγματα κρέατος που
εμβολιάστηκαν με τους παραπάνω μικροοργανισμούς αποθηκεύτηκαν σε
θερμοκρασίες 4οC και 10οC.
Από την καταγραφή της μικροβιακής ανάπτυξης, τα δείγματα που
αποθηκεύτηκαν στους 4οC εμφάνισαν φάση προσαρμογής κάτι που δεν συνέβη με τα
δείγματα που ήταν αποθηκευμένα στους 10οC. Ο μέγιστος ρυθμός αύξησης μmax ήταν
μεγαλύτερος στους 10οC από τους 4οC και για τους δύο μικροοργανισμούς. Για τη
δημιουργία των μοντέλων πρόβλεψης, έγινε χρήση της μερικής γραμμικής
παλινδρόμησης (PLS) κατά την οποία τα δεδομένα από τις μικροβιακές αναλύσεις
χρησιμοποιήθηκαν ως εξαρτημένες μεταβλητές ενώ τα φασματοσκοπικά δεδομένα ως
ανεξάρτητες.
Κατά τη δημιουργία του μοντέλου από τα δεδομένα της πολυφασματικής
ανάλυσης των εικόνων των δειγμάτων επιλέχθηκαν τα μήκη κύματος που είχαν τις πιο
ακραίες τιμές συντελεστών παλινδρόμησης με στόχο την κατασκευή εξισώσεων που θα
εκτιμούν τον πληθυσμό του κάθε μικροοργανισμού. Επίσης κάνοντας χρήση της
ανάλυσης διαχωρισμού PLS-DA έγινε κατηγοριοποίηση των δειγμάτων σε μία από τις 3
xi
κλάσεις ποιότητας που είχαν οριστεί από την οργανοληπτική ανάλυση σε φρέσκο,
ημιφρέσκο και αλλοιωμένο. Η κατηγοριοποίηση σύμφωνα με τη διαχωριστική ανάλυση
έδωσε σωστά αποτελέσματα σε ποσοστό 85.2% για την Serratia liquefaciens και σε
ποσοστό 79.2% για τη Hafnia Alvei. Για την εκτίμηση της απόδοσης των μοντέλων
υπολογίστηκαν οι δείκτες επίδοσης Bias Factor και Accuracy Factor καθώς και ο
συντελεστής συσχέτισης. Οι δείκτες επίδοσης ήταν όλοι κοντά στη μονάδα και για τα
δύο μοντέλα που σημαίνει ότι τα μοντέλα μας είχαν αρκετά καλή προβλεψιμότητα.
Στη συνέχεια αφού έγινε συλλογή των φασματοσκοπικών δεδομένων με το
όργανο του FTIR, εφαρμόστηκε μια προεπεξεργασία στα δεδομένα αυτά ώστε να
κανονικοποιηθούν. Μετά την κανονικοποίηση των δεδομένων υπολογίστηκε η δεύτερη
παράγωγος ώστε να συλλεχθούν τα δεδομένα εκείνα που παρουσιάζουν ακρότατα έτσι
ώστε να μειωθεί ο όγκος των δεδομένων που χρησιμοποιούνται για τη δημιουργία του
μοντέλου πρόβλεψης. Το μοντέλο που δημιουργήθηκε εμφάνισε αρκετά καλή
συσχέτιση μεταξύ παρατηρούμενων και προβλεπόμενων τιμών και η επικύρωσή του με
βάση τους δείκτες επίδοσης ήταν επιτυχής. Τέλος, εφαρμόστηκε μια ιεραρχική
ομαδοποίηση για το χωρισμό του συνολικού φάσματος σε επιμέρους ομάδες.
Αναπτύχθηκαν μοντέλα για την κάθε ομάδα και είδαμε κατά πόσον αυτά τα μοντέλα θα
μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν αντί ενός μοντέλου για όλο το σύνολο των δεδομένων
μειώνοντας κατ’ αυτόν τον τρόπο τον όγκο των δεδομένων και φαινόμενα όπως η
πολυσυγγραμικότητα. Τελικά, τα μοντέλα για δύο ομάδες από αυτές που
δημιουργήθηκαν είχαν καλή προβλεψιμότητα και θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν
για να προσδιορίσουν ξεχωριστά το καθένα την ταυτότητα της αλλοίωσης.
Λέξεις κλειδιά: αλλοίωση κρέατος, μεταβολίτες, πολύφασματική ανάλυση
εικόνας, φασματοσκοπία υπερύθρου, πολύμεταβλητή στατιστική
Meat is a source of various nutrients for humans but in the same time is
considered as hearth of the concentration of microbial groups. These groups found in
the meat surface components that favour the development and function of their
metabolism. The metabolism leads to intermediate and final products, the metabolites,
which eventually alter the organoleptic characteristics of meat. Direct recording and
analysis of metabolites can give quick and reliable results on the level of the spoilage.
For this reason, a new field of research has been developed recently, metabolomics,
which combines different sectors of science such as microbiology, mathematics and
computer science in order to develop models that estimate qualitatively and
quantitatively the microbial population. The application of these models can provide
relatively accurate information on the quality of meat.
In this field of research analytical and rapid methods are applied such as
spectroscopy and multivariate statistical analysis. In the present work two innovative
techniques were assessed. The first was the Fourier transform infrared spectroscopy
(FTIR) and the second was the multispectral image analysis, which use a band of 18
wavelengths by the VideometerLab instrument. The data collected by these methods
after the interaction of light on the surface of meat samples were combined with the
data from the microbial analysis. Two species of the family of Enterobacteriaceae were
chosen in order to study their metabolic profile. The two microorganisms were Serratia
liquefaciens and Hafnia Alvei which are psychotropic and Gram negative bacteria
belonging to the main spoilage microorganisms. Samples of sterile meat were inoculated
with the above microorganisms and were stored at two different temperatures namely,
4oC and 10oC.
By recording the microbial growth, the samples stored at 4oC showed lag phase
which was not the case with the samples stored at 10oC. The maximum growth rate μmax
was greater at 10oC than at 4oC for both microorganisms. For the development of
predictive models linear regression was applied using the microbiological data as the
dependent variable and the spectral data as independent variables. After developing the
predictive model using the data from the analysis of multispectral images of meat
samples the important wavelengths, which had the most extreme regression coefficients
values, were selected. Relying on these values two equations were constructed that
estimate the population of each microorganism. Also using discriminant function
analysis the samples were classified into one of the three classes defined by sensory
analysis in fresh, semifresh and spoiled. Categorization according to discriminant
analysis gave correct results in rate 85.2%. for Serratia liquefaciens and 79.2% for Hafnia
Alvei. To assess the performance of the model performance indicators were calculated
such as Bias Factor, Accuracy Factor and correlation coefficient. All the performance
indicators were close to unit for both models indicating that our models had fairly good
predictability.
xiii
Next step was the selection of spectral data from FTIR. Firstly, a pretreatment was
applied to data for their normalization. After normalization the second derivative was
calculated in order to select data with extreme values minimizing the range of data.
These data was used to generate the predictive model. The predictive model showed
fairly good correlation between observed and predicted values and the model was
successfully validated by the indicator factors. Finally, an hierarchical cluster analysis
was applied for the separation of the overall spectrum into sub-groups. Predictive
models for each group were developed in order to investigate whether these models
could be used instead of a model with the entire data set by reducing in this way the
volume of data and phenomena such as multilinearity. Finally, the performance two of
the models examined was satisfactory and these models could be used individually to
identify the identity of the spoilage.
Key words: meat spoilage, metabolites, multispectral imaging, infrared
spectroscopy, multivariate statistics.