Μελέτη των παραγόντων που επηρεάζουν την προσκόλληση και τη μετέπειτα εσωτερικοποίηση τροφιμογενών παθογόνων μικροοργανισμών σε φυλλώση λαχανικά καθώς και μελέτη της φυσιολογίας τους

Abstract

Ο παθογόνος μικροοργανισμός Salmonella spp. δύναται να εποικίσει φυλλώδη λαχανικά είτε επιφανειακά (προσκόλληση) είτε διεισδύοντας στο εσωτερικό τους (εσωτερικοποίηση), μέσω φυσικών ανοιγμάτων (π.χ. στομάτια) ή τραυματισμών (π.χ. λόγω τομής) του ιστού. Παρά την αυξημένη επικινδυνότητα των λαχανικών εξαιτίας της ανεπάρκειας των συμβατικών μεθόδων απολύμανσης ενάντια στα εσωτερικοποιημένα κύτταρα, πληροφορίες σχετικά με τη φυσιολογία των τελευταίων και τους πιθανούς μηχανισμούς ανθεκτικότητας είναι περιορισμένες. Σκοπός της παρούσας έρευνας ήταν η εκτίμηση α) της ικανότητας προσκόλλησης και εσωτερικοποίησης του Salmonella enterica σε φυλλώδη λαχανικά, β) της οξεοανθεκτικότητας των προσκολλημένων και εσωτερικοποιημένων κυττάρων, γ) των επιπέδων έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται με τη λοιμωξιογόνο δράση και το εκκριτικό σύστημα T3SS (hilA, prgH, invA, avrA, ssrB) και τους μηχανισμούς απόκρισης έναντι καταπονήσεων (cadB, proV) στις ανωτέρω κατηγορίες κυττάρων και δ) των παραγόντων όπως η σύσταση του λαχανικού, η παρουσία ενδογενούς χλωρίδας και η μικροδομή του τροφίμου (υποστρώματος) στην μετέπειτα απόκριση του μικροοργανισμού έναντι όξινης καταπόνησης. Σπανάκι, μαρούλι, βλίτα, ιταλικά χόρτα και ρόκα εμβολιάστηκαν με Salmonella Enteritidis, Typhimurium και Infantis, ξεχωριστά, με τη μέθοδο της εμβάπτισης (7 log CFU/mL) και συντηρήθηκαν για 2h και 48h στους 5oC και 20oC (n=6). Εν συνεχεία, εκτιμήθηκε ο ανακτώμενος ολικός, προσκολλημένος (μέθοδος επιχρίσματος) και εσωτερικοποιημένος (ύστερα από εξυγίανση της φυλλικής επιφάνειας με 1% w/v AgNO3) πληθυσμός του Salmonella καθώς και η επιβίωση του εκάστοτε υποπληθυσμού έναντι ακραίας όξινης καταπόνησης pH 2.7 (HCl). H μεταβολή των επιπέδων της γονιδιακής έκφρασης πραγματοποιήθηκε με RT–qPCR (n=3), ενώ το 16SrRNA χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο αναφοράς. Επιπλέον, προκειμένου να μελετηθεί το πώς επιδρά η σύσταση των μελετούμενων λαχανικών στην επιβίωση του παθογόνου, εκχυλίσματα από το εκάστοτε λαχανικό εκτέθηκαν σε συνθήκες όξινης καταπόνισης pH 2.7 (HCl), επίσης. [7] Ο προσκολλημένος και εσωτερικοποιημένος πληθυσμός του Salmonella spp. μετά από 2 h συντήρησης ανερχόταν περίπου στους 3.6-4.8 και 3.2-5.0 log CFU/g, αντίστοιχα, με τη μεγαλύτερη εσωτερικοποίηση να παρατηρείται στο σπανάκι και στα ιταλικά χόρτα (P<0.05). Παραμονή των εμβολιασμένων λαχανικών για 48 h στους 20oC είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση των ανακτώμενων προσκολλημένων και εσωτερικοποιημένων πληθυσμών κατά 1-2 log CFU/g, εξαιτίας είτε της ανάπτυξης του εκάστοτε υποπληθυσμού, είτε της αύξησης της προσκόλλησης και εσωτερικοποίησης, γεγονός που συμφωνεί με την παρατηρηθείσα επαγωγή της έκφρασης (10-100 φορές) γονιδίων του T3SS. Διαφορές στους εσωτερικοποιημένους πληθυσμούς (0.5-1.0 log CFU/g) (P<0.05) διαφορετικών οροτύπων παρατηρήθηκαν κυρίως κατά τη συντήρηση στους 5oC. Αυξημένη οξεοανθεκτικότητα παρουσίασαν τα προσκολλημένα κύτταρα έναντι των εσωτερικοποιημένων, ενώ παραμονή του Salmonella σε χαμηλή θερμοκρασία ευαισθητοποίησε τον παθογόνο έναντι ακραίας όξινης καταπόνησης. Τέλος, αυξημένη οξεοανθεκτικότητα παρουσίασαν τα εσωτερικοποιημένα κύτταρα σε μαρούλι και βλίτα, που είχαν συντηρηθεί στους 20oC, δεδομένου του επιβιώσαντα πληθυσμού (1.0 log CFU/g) ύστερα από 60 min σε pH 2.7. Σε ότι αφορά τα εκχυλίσματα των λαχανικών, η παρουσία ή η απουσία της ενδογενούς μικροχλωρίδας δεν είχε σημαντικό ρόλο στην οξεοανθεκτικότητα του παθογόνου αλλά τα θρεπτικά συστατικά από τα οποία απαρτιζόταν το καθένα. Τα παραπάνω αποτελέσματα συμβάλλουν στην πληρέστερη κατανόηση της φυσιολογίας του παθογόνου Salmonella spp. κατά την εποίκισή του σε φυλλώδη λαχανικά και μπορούν να αξιοποιηθούν στην καλύτερη εκτίμηση της επικινδυνότητας στον τομέα των λαχανικών.

Salmonella colonizes or penetrates leafy greens. The ability of internalized bacteria to evade common disinfection practices, poses a well-established risk. Nevertheless, little is known about the physiology of internalized cells and the underpinning stress resistance mechanisms. The aims of the study were: i) to assess the attachment and internalization of different Salmonella enterica serotypes regarding different leafy vegetables, ii) to evaluate the acid tolerance of internalized and attached cells, iii) to monitor the transcriptional changes regarding stress (cadB, proV) and virulence/ secretion system- T3SS associated genes (hilA, prgH, invA, avrA, ssrB), associated with the aforementioned two cell types and iv) to evaluate how affect the compounds of vegetables and the presence of native microflora to response of microorganism under acid tolerance. Spinach, lettuce, green amaranth, arugula and endive were inoculated by immersion (7 log CFU/mL), individually, with Salmonella Enteritidis, S. Typhimurium and S. Infantis and stored at 5oC and 20oC for 2h and 48h (n=6). Population of total, attached (swab method) and internalized (after surface decontamination with 1% w/v AgNO3) Salmonella, as well as their survival against pH 2.7 (HCl) were assessed. Transcriptional changes were determined using quantitative Real Time-PCR (n=3), while 16SrRNA served as a reference gene. Also, survival of Salmonella was assessed against pH 2.7 (HCl) on extracts of vegetables. Spinach and endive allowed the highest (P<0.05) internalization of the target organism, while attached and internalized Salmonella, 2 h after inoculation, reached 3.6-4.8 and 3.2-5.0 log CFU/g. Storage of vegetables for 48h at 20oC increased the recovery of attached and internalized Salmonella by 1-2 log CFU/g, though it is unknown whether this derives from growth and/or spreading by swarming, swimming, or additional colonization. However, habituation of Salmonella at 20oC induced the transcription (10-100 folds) of T3SS-related genes. Inter-serovar variation regarding the internalization ability was evident (0.5-1.0 log CFU/g) only at refrigeration temperature. Regarding acid tolerance response, attached cells exhibited higher survival rates against low pH than the [9] internalized ones. Acid sensitization of Salmonella was a result of habituation at 5oC, while habituation at 20oC on lettuce and amaranth induced acid tolerance of internalized cells, manifested by 1.0 log CFU/g survival after 60 min at pH 2.7. As regards, the extracts of vegetables, the compounds of each vegetable affects on survival of microorganism and not native microflora. Our findings reveal physiology aspects of Salmonella colonizing leafy vegetables and therefore could be supportive material in quantitative risk assessment of pathogens in fresh produce sector