Στοχαστική προσέγγιση της επίδρασης ήπιων συνθηκών καταπόνησης στην αύξηση του παθογόνου Listeria monocytogenes και στην κινητική θανάτωσης κατά τη διάρκεια όξινης καταπόνησης.

Abstract

Ο Listeria monocytogenes αποτελεί παθογόνο μικροοργανισμό τροφιμογενούς προέλευσης, με αυξημένη ικανότητα προσαρμογής και επιβίωσης υπό αντίξοες περιβαλλοντικές συνθήκες. Σε προηγούμενη μελέτη έχει δειχθεί ότι η παραμονή του L. monocytogenes σε συνθήκες ήπιας ωσμωτικής και όξινης καταπόνησης εκατέρωθεν των ορίων ανάπτυξης έχει επίδραση στην ικανότητα ανάπτυξης και επιβίωσής του σε συνθήκες ήπιας όξινης καταπόνησης και στα επίπεδα έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται με την αντιμετώπιση καταπονήσεων και την παθογένεια. Στόχος της παρούσας μελέτης είναι η εκτίμηση της επίδρασης της βιολογικής και πειραματικής παραλλακτικότητας κατά την προετοιμασία της καλλιέργειας στη στοχαστική απόκριση του L. monocytogenes στην: (α) ανάπτυξη, (β) οξεοανθεκτικότητα και (γ) μεταγραφή γονιδίων σχετιζόμενων με αντιμετώπιση καταπονήσεων (gad2- glutamate decarboxylase 2, sigB-sigma B factor) και λοιμωξιογόνο δράση (prfA- positive regulatory factor), έναντι συνδυασμών pH και NaCl εκατέρωθεν των ορίων ανάπτυξης/ μη ανάπτυξης του μικροοργανισμού στους 7°C. Για την εκτίμηση της πειραματικής παραλλακτικότητας, εμβόλια του στέλεχους C5 (ορότυπος 4b) του L. monocytogenes παρασκευάστηκαν από (α) διαφορετικές αποικίες (C), (β) ίδια αποικία και διαφορετική Β’ ανανέωση (B) ίδια αποικία και ίδια Β’ ανανέωση (T), ενώ για την εκτίμηση της βιολογικής παραλλακτικότητας πραγματοποιούταν επανάληψη ολόκληρου του πειραματικού σχεδιασμού (Dates, n=3). Θρεπτικό υπόστρωμα TSB με 0.6 % w/v Yest Extract παρασκευασμένο με διαφορετικούς συνδυασμούς pH (4.8-7.2) και NaCl (0-10% w/v), εμβολιάστηκε με 107 log CFU/mL L. monocytogenes και συντηρήθηκε στους 7oC. Η παρακολούθηση της ανάπτυξης πραγματοποιήθηκε με μέτρηση της οπτικής πυκνότητας σε τριβλία μικροτιτλοδότητησης 96-θέσεων για διάστημα 20 ημερών (n=15x3) και τα δεδομένα της οπτικής πυκνότητας που χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό του ρυθμού αύξησης, του χρόνου προσαρμογής και του εμβαδού υπο της καμπύλης ανάπτυξης. Η ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (Quantitative Real time PCR) 9 χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της μεταβολής των επιπέδων σχετικής μεταγραφής γονιδίων , μετά από 24 ώρες έκθεση σε επιλεγμένες υποθανάτιες συνθήκες pH-NaCl (n=5x3) (Folds Change, FC), ενώ η επιβίωση σε μετέπειτα έκθεσή σε όξινη καταπόνηση (TSBYE pH 2.0, HCl, 37oC, μέχρι 35 min) εκτιμήθηκε με τον προσδιορισμό των τιμών D-values προσαρμόζοντας τα δεδομένα σε δι-φασικά μοντέλα απενεργοποίησης (GinaFiT freeware) (n=5x3). Για την ποσοτικοποίηση της πειραματικής και βιολογικής παραλλακτικότητας, καθώς και για την παραλλακτικότητα που προέκυψε από την προέλευση των εμβολίων (B.C.T) χρησιμοποιήθηκε ο συντελεστής μεταβλητότητας Coefficient of variation (%) και η ρίζα μέσου τετραγώνου σφάλματος and root mean square error (RMSE). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι υψηλή πειραματική παραλλακτικότητα στην ικανότητα ανάπτυξης του παθογόνου παρατηρήθηκε σε συνθήκες κοντά στα όρια ανάπτυξης-μη ανάπτυξης του μικροοργανισμού (στους 7oC ) όπως pH 5.5-6.4 και NaCl 2-8% w/v, όπως φάνηκε από τη μεγάλη διακύμανση των παραμέτρων ανάπτυξης (CVareas 18.3% - 49%, RMSEΕ 8.7-13.9, RMSElag time 9.3-31.2), ενώ, χαμηλή παραλλακτικότητα στη βακτηριακή απόκριση παρατηρήθηκε σε ευνοϊκές για την ανάπτυξη του παθογόνου συνθήκες pH 7.2 (RMSEareas 5.9, RMSElagtime 5.35). O εγκλιματισμός του παθογόνου σε συνθήκες pH 5.0-5.5 και NaCl 2% w/v είχε ως αποτέλεσμα την εμφάνιση οξεοανθεκτικότητας σε μετέπειτα ισχυρή όξινη καταπόνηση (pH 2.0) με τιμές D1pH:2.0-values (3-21 min) και D2pH:2.0-values (14-36 min). Η πειραματική παραλλακτικότητα στη βακτηριακή απόκριση στις συνθήκες που επάγουν οξεοανθεκτικότητα ήταν υψηλή (CVD1 28-35%, CVD2 35-60%) σε αντίθεση με αυτήν στις συνθήκες pH 6.0-7.2 και NaCl 4-8% w/v που εμφάνισαν χαμηλή πειραματική παραλλακτικότηα CVD2<35% και χαμηλή οξεοανθεκτικότητα. Οι διαφορετικοί τρόποι προετοιμασίας του εμβολίου είχαν ως αποτέλεσμα την εμφάνιση παρόμοιων επιπέδων παραλλακτικότητας γεγονός που υποδεικνύει ότι οι συνθήκες ανάπτυξης μπορεί να έχουν μεγαλύτερη επίδραση στην στοχαστική απόκριση του μικροοργανισμού. Τα επίπεδα βιολογικής παραλλακτικότητας ήταν χαμηλότερα ή κοντά σε αυτά της πειραματικής παραλλακτικότητας σε όλες τις παραμέτρους ανάπτυξης που μελετήθηκαν (εκτός από το εμβαδόν υπό της καμπύλης ανάπτυξης) κάτι που υποδεικνύει ότι ο μεγάλος αριθμός των πειραματικών επαναλήψεων επαρκεί για την περιγραφή της στοχαστικής απόκρισής του μικροοργανισμού. Όσον 10 αφορά στη μεταγραφή των γονιδίων, ενώ τα επίπεδα έκφρασης του sigB παρέμειναν σταθερά ή μειώνονταν σε όλες τις συνθήκες που μελετήθηκαν, η παραμονή σε pH 5.2 και NaCl 2% w/v που επάγει οξεοανθεκτικότητα είχε ως αποτέλεσμα τη θετική μεταβολή των επιπέδων έκφρασης του gad2 (FC 500-1500) με υψηλή πειραματική παραλλακτικότητα RMSEfoldschange 2.8, ενώ τα επίπεδα σχετικής μεταβολής του prfA κυμαίνονταν από 0.60 έως 4.22 Τα παραπάνω δεδομένα δύνανται να συνεισφέρουν στη στοχαστική περιγραφή της επιβίωσης και ανάπτυξης του παθογόνου μικροοργανισμού L. monocytogenes σε συνθήκες πλησίον των ορίων ανάπτυξης/ μη ανάπτυξης του μικροοργανισμού καθώς και να αναδείξουν την υποβόσκουσα επικινδυνότητα στις πειραματικές προσεγγίσεις της απόκρισης του παθογόνου υπό οριακές για την ανάπτυξη συνθήκες.

Listeria monocytogenes is a foodborne pathogen with high adaptive response potential, capable of surviving under stringent environmental conditions. In a previous study it was shown that habituation of L. monocytogenes across marginal for growth acid and osmotic conditions has an impact on growth, survival under low acidic conditions and transcription levels of stress- and virulence- associated genes. The aim of this study was to evaluate the impact of biological and experimental variability during culture preparation of Listeria monocytogenes on the stochastic outcome of: (i) growth (ii) acid resistance and (iii) relative transcription of stress- and virulence- associated genes, such as glutamate decarboxylase system (gad2) sigma factor B (sigB) and positive regulatory factor A (prfA), in response to pH and NaCl combinations near and across the growth/no growth interface of the organism at 7°C. In order to assess experimental variability, L. monocytogenes strain C5 (serotype 4b) inocula were prepared from: i) different colonies (B), ii) same colony and different second activation (B) and iii) same colony and same second activation (T). In addition, biological replicates (Date) corresponded to independent reproductions (n=3) of the entire experimental set up. Tryptic Soy Broth supplemented with 0.6% w/v yeast extract (TSBYE) and various combinations of NaCl (0-8 % w/v) and pH (4.8-7.2) (HCl) was inoculated with ca. 10 7 CFU/mL of L. monocytogenes and stored at 7 C. Growth was monitored via optical density (620 nm) in 96-well microplates for a 20-day period (n=15x3) and OD data were used to estimate growth rate and lag time (DMFit) as well as the area under the generated growth curve. Quantitative Real time PCR was used to evaluate gene transcriptional changes (24h post inoculation) (n=5x3) (Folds Change, FC), while survival under subsequent acidic conditions (TSBYE pH 2.0, HCl, 37 C, up to 35 min) was assessed using D-values determined by fitting the biphasic model without shoulder of GinaFiT freeware (n=5x3). Coefficient of variation (%) and root mean square error (RMSE) was used to quantify experimental and biological variability, as well as the variability derived from the inoculum preparation (B,C,T). o o 6 Results showed that high experimental variability regarding growth potential of the pathogen, is observed in conditions across growth boundaries (at 7 o C), such as pH 5.5-6.4 and NaCl 2-8% w/v, as manifested by the highly ranged growth parameters (CV areas

18.3% - 49%, RMSE areas 8.7-13.9, RMSE lag time 9.3-31.2) in contrast to low variability of bacterial response under optimum growth conditions, pH 7.2, (RMSE areas 5.35. Habituation of the bacterium under pH 5.0-5.5 and NaCl 2% w/v resulted in high acid resistance against subsequent lethal pH, manifested by D1 pH:2.0 -values (3-21 min) and D2 pH:2.0 -values (14-36 min). Experimental variability in bacterial response under these acid adaptation inductive conditions was high (CV D1 5.9,

28-35%, CV D2 35-60%). contrary to habituation of L. monocytogenes at pH 6.0-7.2 and NaCl 4-8% w/v that resulted in lower experimental variability CV D2 <35% and reduced acid tolerance. Different preparation of bacterial inoculum resulted in similar variabilities, indicating that growth conditions may have greater effect on heterogeneity of bacterial response. Biological variability was close or less than experimental variability regarding all parameters tested (except area), given that the number of experimental replicates was adequate to well describe bacterial varying response. As regards gene transcription, while sigB was unchanged or even downregulated in all tested conditions, habituation at pH 5.2 and NaCl 2% w/v that induced acid adaptation, resulted in the upregulation of gad2 (FC 500-1500) with experimental variability of RMSE foldschange 2.8, while relative transcription levels of pfrA ranged from 0.60 to 4.22. These findings could contribute to the stochastic assessment of L. monocytogenes survival and growth responses close to the growth boundaries and pinpoint the underlying concerns in experimental approaches assessing the stress response of pathogens under growth limiting conditions