Βιοτεχνολογική παραγωγή 1,3-προπανοδιόλης, 2,3-βουτανοδιόλης και αιθανόλης κατά την αύξηση επιλεγμένων προκαρυωτικών στελεχών σε ανανεώσιμες πηγές άνθρακα.

Abstract

Στην παρούσα µελέτη εξετάστηκε η ικανότητα 84 βακτηριακών στελεχών να µεταβολίσουν τη βιοµηχανική γλυκερόλη, κύριο παραπροϊόν της διαδικασίας παραγωγής βιολογικού πετρελαίου (βιοντίζελ), προς παραγωγή 1,3-προπανοδιόλης (PD), 2,3-βουτανοδιόλης (BD) και αιθανόλης (EtOH), υπό διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας. Τα εξεταζόµενα στελέχη ανήκουν, πλην ενός (Clοstridium butyricum NRRL B-23495), σε συλλογές του τµήµατος Επιστήµης και Τεχνολογίας Τροφίµων του Γεωπονικού Πανεπιστηµίου Αθηνών, είναι φυσικά στελέχη και µελετήθηκαν για πρώτη φορά ως προς τη δυνατότητα µεταβολισµού της γλυκερόλης. Στην πλειοψηφία τους έχουν αποµονωθεί από τρόφιµα όπως προϊόντα κρέατος, προζύµι και καρπούς σταφυλής προσβεβληµένους από τον µύκητα Botrytis sp.. Η πειραµατική διαδικασία χωρίστηκε σε δύο στάδια: Αρχικά διενεργήθηκαν ασυνεχείς καλλιέργειες σε φιάλες, µε την καθαρή γλυκερόλη και την γλυκόζη ως συνυποστρώµατα σε αναλογία 3:1, είτε υπό αναερόβιες είτε υπό αερόβιες συνθήκες ανάλογα µε τις απαιτήσεις σε οξυγόνο του εκάστοτε µικροοργανισµού. Η επιλογή της καθαρής γλυκερόλης έγινε µε στόχο την αποφυγή φαινοµένων παρεµπόδισης εξαιτίας προσµίξεων που περιέχονται στην βιοµηχανική γλυκερόλη, ενώ η προσθήκη γλυκόζης στο µέσο της καλλιέργειας κρίθηκε σκόπιµη, καθώς το υπόστρωµα αυτό δύναται να ενισχύσει τη µικροβιακή αύξηση και ως εκ τούτου, ενδεχοµένως, να διευκολύνει τον µεταβολισµό της γλυκερόλης από τα υπό µελέτη στελέχη. Από τα 84 στελέχη, αν και όλα παρουσίασαν κυτταρική αύξηση, µόνο 16 αφοµοίωσαν την γλυκερόλη. Σε δεύτερη προσέγγιση τα 16 αυτά στελέχη αναπτύχθηκαν σε ασυνεχείς καλλιέργειες σε φιάλες µε πηγή άνθρακα την βιοµηχανική γλυκερόλη. Αφού συνεκτιµήθηκε τόσο η κατανάλωση της γλυκερόλης όσο και η παραγωγή των τριών κύριων µεταβολιτών (1,3-προπανοδιόλη, 2,3-βουτανοδιόλη και αιθανόλη), επιλέχθηκαν για περαιτέρω µελέτη τα ακόλουθα τέσσερα στελέχη: Citrobacter freundii FMCC-B 294 (VK-19), C. freundii FMCC-207, Klebsiella oxytoca FMCC-197 και Enterobacter aerogenes FMCC-10. Σηµειώνεται ότι παρά την ικανοποιητική παραγωγή 1,3-προπανοδιόλης από το στέλεχος Cl. butyricum NRLL B-23495 στο αρχικό στάδιο της πειραµατικής διαδικασίας (µέγιστη συγκέντρωση 1,3-προπανοδιόλης 32,2 g/L και συντελεστής απόδοσης παραγόµενης 1,3προπανοδιόλης ανα καταναλωθείσα γλυκερόλη 0,58 g/g), δεν διενεργήθηκαν περαιτέρω µελέτες µε

τον

εν λόγω µικροοργανισµό, δεδοµένου ότι τα αποτελέσµατα αυτών των καλλιεργειών αποτέλεσαν τη βάση σύγκρισης για την κατανάλωση γλυκερόλης και παραγωγή 1,3-προπανοδιόλης µε τα υπόλοιπα στελέχη. Στο δεύτερο στάδιο της πειραµατικής διαδικασίας διερευνήθηκαν καλλιέργειες των τεσσάρων στελεχών, σε υποστρώµατα µε βάση την βιοµηχανική γλυκερόλη. Μελετήθηκε η επίδραση διαφορετικών τύπων ακατέργαστης γλυκερόλης, η επίδραση της αρχικής συγκέντρωσης του υποστρώµατος, καθώς και των συνθηκών καλλιέργειας (συνθήκες pH, αεροβίωση/αναεροβίωση, τρόπος επίτευξης αναεροβίωσης), στην αύξηση και την παραγωγή µεταβολικών προϊόντων. Και τα τέσσερα στελέχη µεταβόλισαν σηµαντικές ποσότητες γλυκερόλης, µε µέγιστη συγκέντρωση καταναλωθέντος υποστρώµατος ~217,0 g/L, στην ηµι-συνεχή καλλιέργεια του στελέχους E. aerogenes FMCC-10, υπό αερόβιες συνθήκες. Η µέγιστη συγκέντρωση 1,3-προπανοδιόλης (PD max ) 68,1 g/L, σηµειώθηκε σε αναερόβια ηµι-συνεχή καλλιέργεια του στελέχους C. freundii FMCC-B 294 (VK-19), µε τον αντίστοιχο συντελεστή απόδοσης παραγόµενης 1,3-προπανοδιόλης ανά καταταλωθείσα γλυκερόλη (Y

) να λαµβάνει τιµή Y =0,40 g/g και η παραγωγικότητα 0,79 g/L/h. Παράλληλα σηµαντική ποσότητα της διόλης (50,1 g/L) σχηµατίστηκε κατά την ηµι-συνεχή τροφοδοτούµενη καλλιέργεια του στελέχους K. oxytoca FMCC-197, υπό συνθήκες αυτό-παραγόµενης αναεροβίωσης. Και οι δύο τιµές αποτελούν τις µέγιστες συγκεντρώσεις της διεθνούς βιβλιογραφίας για παραγωγή 1,3προπανοδιόλης

από φυσικά στελέχη για τα συγκεκριµένα είδη και συγκαταλέγονται στις υψηλότερες τιµές παραγωγής 1,3-προπανοδιόλης από βιοµηχανική γλυκερόλη. Με βάση τα όσα είµαστε σε θέση να γνωρίζουµε, είναι η πρώτη φορά που πραγµατοποιείται αύξηση του είδους K. oxytoca σε ακατέργαστη γλυκερόλη. PD/Gly Αναφορικά µε την µέγιστη συγκέντρωση 2,3-βουτανοδιόλης (BD ) σε υπόστρωµα ακατέργαστης γλυκερόλης, που ήταν 78,2 g/L, καταγράφηκε κατά την αύξηση του στελέχους E. aerogenes FMCC-10 σε ηµι-συνεχή τροφοδοτούµενη καλλιέργεια υπό αερόβιες συνθήκες. Στην εν λόγω καλλιέργεια εφαρµόστηκε η τεχνική του διακυµαινόµενου pH, σύµφωνα µε την οποία µετά από κάθε ανατροφοδότηση, το pH αυξάνονταν στην τιµή 7,0 και στη συνέχεια έµενε µη σταθερό, συνδυάζοντας έτσι δύο παραµέτρους που βρέθηκε ότι επηρεάζουν την παραγωγή της 2,3βουτανοδιόλης. Αφενός µεν ήταν µη-ελεγχόµενο σε ελαφρώς όξινο εύρος pH, γεγονός απαραίτητο

για

την σύνθεση της διόλης, αφετέρου δε, δεν ξεπέρασε µια κατώτατη τιµή pH που είναι παρεµποδιστική για τον µεταβολισµό της γλυκερόλης. Σηµειώνεται ότι είναι η πρώτη φορά που µελετήθηκε η παραγωγή 2,3-βουτανοδιόλης ως το κύριο προϊόν ζύµωσης από ακατέργαστη γλυκερόλη, καθώς το υπόστρωµα αυτό έχει συνδεθεί στενά µε την προπανοδιολική ζύµωση, κατά την οποία η 2,3-βουτανοδιόλη αποτελεί παραπροϊόν της ζύµωσης και παράγεται σε αρκετά µικρότερες ποσότητες. Ως εκ τούτου, η τιµή αυτή αποτελεί την µέγιστη της διεθνούς βιβλιογραφίας που έχει αναφερθεί τόσο σε υπόστρωµα καθαρής όσο και βιοµηχανικής γλυκερόλης. Συγχρόνως, αποτελεί ενδιαφέρο εύρηµα η σύνθεση του µεταβολίτη από γλυκερόλη υπό αερόβιες συνθήκες, δεδοµένου ότι ο µεταβολισµός της γλυκερόλης τελείται, κατά κύριο λόγο, υπό αναερόβιες συνθήκες. Ιδιαίτερα υψηλή ήταν και η µέγιστη παραγόµενη ποσότητα αιθανόλης (EtOH PD/Gly max ) από βιοµηχανική γλυκερόλη, που ήταν 33,4 g/L και σηµειώθηκε στην καλλιέργεια του στελέχους C. max freundii FMCC-207, κατά την αύξηση του σε αναερόβια ηµι-συνεχή τροφοδοτούµενη καλλιέργεια. Η συγκέντρωση αυτή αποτελεί, µέχρι στιγµής, την υψηλότερη τιµή της διεθνούς βιβλιογραφίας τόσο από φυσικά όσο και από ανασυνδυασµένα στελέχη, κατά την καλλιέργεια τους σε υποστρώµατα µε βάση την βιοµηχανική γλυκερόλη. Εξίσου υψηλές ποσότητες σχηµατίστηκαν και στις ηµι-συνεχείς καλλιέργειες των στελεχών K. oxytoca FMCC-197 και E. aerogenes FMCC-10 (25,2 και 20,9 g/L, αντίστοιχα). Τέλος, µια ακόµη παράµετρος που εξετάστηκε ήταν η εφαρµογή των µη-ασηπτικών συνθηκών καλλιέργειας στην αφοµοίωση της γλυκερόλης και στην σύνθεση µεταβολικών προϊόντων, κατά την διενέργεια ασυνεχών και ηµι-συνεχών τροφοδοτούµενων καλλιεργειών. Σε όλες τις περιπτώσεις, η απουσία στείρων συνθηκών αποδείχθηκε ότι δεν έχει σηµαντική επίδραση στον µεταβολισµό της γλυκερόλης και από τα τέσσερα εξεταζόµενα στελέχη, ωστόσο σηµειώθηκε µικρή µείωση στην τελική συγκέντρωση των παραγόµενων µεταβολικών προϊόντων, συγκριτικά µε τις αντίστοιχες καλλιέργειες σε στείρες συνθήκες. Τα αποτελέσµατα αυτά αποδεικνύουν ότι η απουσία ασηπτικών συνθηκών καλλιέργειας µπορεί να αποτελέσει µια ενδιαφέρουσα παράµετρο για την αξιοποίηση της ακάθαρτης γλυκερόλης προς προϊόντα υψηλότερη αξίας σε βιοµηχανικό επίπεδο, καθώς η εφαρµογή των µη-ασηπτικών συνθηκών ελαχιστοποιεί το κόστος ενέργειας για την αποστείρωση, αλλά και το συνολικό κόστος για τον εξοπλισµό. Μαζί µε την αξιοποίηση της χαµηλού κόστους ακατέργαστής γλυκερόλης ως υπόστρωµα, αυτή η εφαρµογή θα βοηθήσει την µικροβιακή µετατροπή της ακατέργαστης γλυκερόλης προς 1,3-προπανοδιόλη, 2,3-βουτανοδιόλη και αιθανόλη ώστε να γίνει µια οικονοµικά ανταγωνιστική βιολογική διεργασία.

The ability of bacterial strains to assimilate glycerol, the main by-product of biodiesel production facilities, in order to generate higher value compounds of significance for the food and chemical industry, namely 1,3-propanediol (PD), 2,3-butanediol (BD) and ethanol (EtOH), was assessed during the current thesis. Under this view, 84 bacterial strains were screened for their ability to metabolise crude glycerol, under different fermentation conditions. All but one of the tested strains (Clοstridium butyricum NRRL B-23495), were obtained from various collections of the Department of Food Science and Technology of the Agricultural University of Athens and were tested for the first time for their ability to assimilate glycerol. All of these strains were natural ones and were mostly isolated from foodstuffs, such as meat products, fermented sourdoughs and infected grapes. The experimental procedure was divided in two parts: First, a preliminary assessment of glycerol assimilation for all 84 strains was performed in batch-flask cultures using pure glycerol and glucose as co-substrates, at a 3:1 ratio. Pure glycerol was selected as substrate in order to avoid inhibition phenomena caused by the impurities, potentially found in crude glycerol feedstock. Glucose was added with the intention of facilitating microbial growth and consequently glycerol assimilation, by the tested strains. All 84 tested strains were able to grow in the mixture of glycerol and glucose, but only 16, amongst the screened strains, were capable of assimilating glycerol. These 16 strains were further cultivated in batch-flask cultures using crude glycerol as substrate. On completion of the first part of the study, four strains, namely Citrobacter freundii FMCC-B 294 (VK-19), C. freundii FMCC-207, Klebsiella oxytoca FMCC-197 and Enterobacter aerogenes FMCC-10, were chosen for further testing. Selection was based on glycerol consumption and product formation of three main metabolites (1,3-propanediol, 2,3-butanediol and ethanol). Cl. butyricum NRLL B-23495, the strain obtained from the NRLL collection, was also found to have satisfactory production of 1,3-propanediol (maximum 1.3-propanediol concentration 32.2 g/l and yield of 1.3-propanediol produced per glycerol consumed 0.58 g/g). However, this strain was used primarily as a basis for comparison of glycerol consumption and 1,3-propanediol production and thus was not studied further. During the second part of the experimental procedure, the production of 1,3-propanediol, 2,3-butanediol and ethanol was studied, during cultivations of the four selected strains on biodieselderived

glycerol-based media. Feedstock origin, initial glycerol concentration and experimental conditions (pH conditions, anaerobic/aerobic culture conditions, strategy of imposed anaerobiosis, etc) were found to have an important impact on the distribution of metabolic products. All four strains were able to assimilate elevated amounts of crude glycerol and a maximum consumption of ~217.0 g/L was observed during fed-batch fermentation of E. aerogenes FMCC-10 strain, under aerobic conditions. ), 68.1 g/L, was achieved during anaerobic fed-batch fermentation of C. freundii FMCC-B 294 (VK-19), with yield of 1,3propanediol

produced per glycerol consumed Y The maximum 1,3-propanediol concentration (PD PD/Gly max =0.40 g/g and volumetric productivity 0.79 g/L/h. Meanwhile, 50.1 g/ of 1.3-propanediol were produced through a fed-batch fermentation of K. oxytoca FMCC-197 strain, under self-generated anaerobiosis conditions. These are the highest PD concentrations achieved by natural C. freundii and K. oxytoca strains so far and, in general, amongst the highest ones using crude glycerol as substrate, reported in the international literature. To the best of our knowledge, this is the first study dealing with the growth of K. oxytoca strain on raw glycerol. Concerning 2,3-butanediol, a maximum concentration (BD ) of 78.2 g/L was obtained during an aerobic fed-batch fermentation of E. aerogenes FMCC-10. Aiming to maintain pH uncontrolled in slightly acetic conditions, but not below a critical value inhibitory for glycerol consumption, the technique of pH-fluctuations was employed. According to this technique, after every feed during the fed-batch fermentation, the pH was increased to value 7.0 and remained uncontrolled.

This allowed a natural acidification, necessary for 2,3-butanediol synthesis, and at the same time in a pH area suitable for glycerol assimilation. To the best of our knowledge, it is the first time that 2.3-butanediol was synthesized as the principal metabolic product from crude glycerol; so far it has been a by-product of the propanediolic fermentation. Thus, the concentration achieved is the highest reported in literature so far. It is also remarkable that this concentration was obtained under aerobic conditions, while glycerol metabolism is mainly conducted under anaerobic conditions. Another interesting result achieved in the current thesis was the conversion of biodieselderived

crude glycerol into ethanol in significant quantities (EtOH max =33.4 g/L), during anaerobic fed-batch fermentations by C. freundii FMCC-207 strain. This value is, so far, the highest one reported in the international literature, by taking into consideration both natural and mutant strains growing on glycerol. Equally high amounts were formed during feb-batch cultures by K. oxytoca FMCC-197 and E. aerogenes FMCC-10 strains (25.2 και 20.9 g/L, respectively). max Finally, the feasibility of batch and fed-batch cultures under non-sterile conditions was also examined and the absence of sterile cultivation conditions proved to have no considerable effect upon the efficiency of the fermentation in all cases. Compared to the results achieved under sterile conditions, trivial differences were detected on final product concentrations. The achieved results from all studies indicated that absence of sterile cultivation conditions may prove to be an interesting parameter for the industrial application of glycerol conversions by prokaryotic microbialstrains. The implementation of non-sterile conditions minimizes the energy cost for sterilization, aswell as the overall equipment cost. Together with the utilization of low-cost biodiesel-derived crudeglycerol as substrate, this implementation could make the microbial conversion of crude glycerol to1,3-propanediol, 2,3-butanediol and ethanol an economically competitive bioprocess.