Κλωνοποίηση και μελέτη της περιοχής έναρξης αντιγραφής του πλασμιδίου pSMA198 του Streptococcus macedonicus ACA-DC198 στον Lactococcus lactis MG1363

Abstract

Ο Streptococcus macedonicus αποτελεί ένα ενδιαφέρον είδος του γένους Streptococcus και απομονώνεται κυρίως από ζυμούμενα τρόφιμα όπως και ο Streptococcus thermophilus. Όμως ο S. macedonicus είναι συγγενικό είδος με τα ευκαιριακά συμβιωτικά παθογόνα του συμπλέγματος Streptococcus bovis/Streptococcus equinus. Στην παρούσα μελέτη, αναλύθηκε το πλασμίδιο pSMA198, που απομονώθηκε από το γαλακτοκομικό στέλεχος Streptococcus macedonicus ACA-DC 198 με στόχο να βρεθούν νέα στοιχεία σε σχέση με τον κύριο οικολογικό θώκο του βακτηρίου αυτού. Με βάση τις ομοιότητες που είχαν τα προφίλ των αλληλουχιών της πρωτεΐνης έναρξης της αντιγραφής (Rep) και της θέσης έναρξης της αντιγραφής (ori) του πλασμιδίου, το pSMA198 ανήκει στην οικογένεια πλασμιδίων περιορισμένου εύρους ξενιστών pCI305/pWV02. Τα πλασμίδια της οικογένειας αυτής βρίσκονται κυρίως στα είδη του γένους Lactococcus ενώ το πλασμίδιο pSMA198 είναι το πρώτο που αναφέρεται και εντοπίζεται στο γένος Streptococcus. Η συγκριτική ανάλυση της αλληλουχίας του pSMA198 πάνω στις περιοχές ori, στην αρχή έναρξης της μεταφοράς του (oriT) και σε όλο το μήκος του πλασμιδίου εμφάνισαν έναν υψηλό βαθμό ομοιότητας με τα πλασμίδια pSK11, pVF22 και pIL5. Τα πλασμίδια αυτά έχουν απομονωθεί από στελέχη του Lactococcus lactis που προέρχονται από το γάλα ή από προϊόντα του. Η φυλογενετική ανάλυση της πρωτεΐνης Rep του pSMA198 έδειξε ότι η πλειοψηφία των πρωτεϊνών που είναι συγγενείς με αυτήν, προέρχεται από γαλακτοκομικά στελέχη του γένους Lactococcus. Με τα ευρύματα αυτά γίνεται η υπόθεση ότι ο S. macedonicus ACA-DC 198 απέκτησε το πλασμίδιο pSMA198 από τον L. lactis, μέσω οριζόντιας μεταφοράς, μίας γενετικής ανταλλαγής, που συνέβη στο παρελθόν πολύ πιθανόν σε περιβάλλον γάλακτος ή σε γαλακτοκομικά προϊόντα. Προκειμένου να ενισχυθεί η υπόθεση αυτή πειραματικά, κλωνοποιήθηκε η περιοχή έναρξης της αντιγραφής ori-rep-orfX του πλασμιδίου pSMA198, στον Lactococcus lactis MG1363. Με όχημα το πλασμίδιο pUC19, δημιουργήθηκε ένας παλίνδρομος φορέας μεταξύ των στελεχών S. macedonicus ACA-DC 198 και Escherichia coli, το πλασμίδιο pORI198. Το πλασμίδιο αυτό κλωνοποιήθηκε με επιτυχία στο στέλεχος L. lactis MG136, όπου εμφάνισε 100% σταθερότητα για 100 γενεές και αριθμό αντιγράφων (2-3 αντίγραφα ανά κύτταρο) ίδιο με αυτόν του S. macedonicus. Έτσι, δημιουργήθηκε για πρώτη φορά παλλίνδομο πλασμίδιο του S. macedonicus με τον L. lactis, γεγονός που ενισχύει την πιθανότητα ο S. macedonicus να απέκτησε το πλασμίδιο αυτό από τον L. lactis. Με τη μελέτη αυτή, παραθέτονται μοριακά στοιχεία για την προσαρμογή του S. macedonicus στο περιβάλλον του γάλακτος και στα γαλακτοκομικά προϊόντα.

Streptococcus macedonicus is a very interesting species of the genus Streptococcus and it is mostly isolated from fermented foods similarly to Streptococcus thermophilus. However, S. macedonicus is closely related to commensal opportunistic pathogens of the Streptococcus bovis/Streptococcus equinus complex. In this study, in order to provide novel clues about the main ecological niche of the dairy strain Streptococcus macedonicus ACA-DC 198, the pSMA198 plasmid was isolated and analyzed. Based on the sequence similarity profiles of the plasmid’s replication initiation protein (Rep) and origin of replication (ori), pSMA198 belongs to the narrow host range pCI305/pWV02 family found primarily in the genus Lactococcus and it is the first such plasmid to be reported in the genus Streptococcus. Comparative analysis of the pSMA198 sequence over its ori, origin of transfer (oriT) or entire length revealed a high degree of similarity with plasmids pSK11b, pVF22 and pIL5, respectively isolated from Lactococcus lactis strains deriving from milk or its products. Phylogenetic analysis of the pSMA198 Rep protein showed that the vast majority of closely related proteins derive from dairy isolates within the genus Lactococcus. According to these findings it is assumed that S. macedonicus ACA-DC 198 acquired pSMA198 plasmid from L. lactis via an ancestral genetic exchange event that took place most probably in milk or dairy products. To strengthen this hypothesis experimentally, the origin of replication region (ori-rep-orfX) of the pSMA198 plasmid, was cloned in L. lactis MG1363. Having as a vehicle the pUC19 plasmid, there was created the pORI198 plasmid, a shuttle vector between the stains S. macedonicus ACA-DC 198 and Escherichia coli. This plasmid was successfully cloned in the stain L. lactis MG1363, where it was 100% stable for 100 generations and its plasmid copy number (2-3 copies per cell) was the same with S. macedonicus. Therefore, this is the first time a shuttle vector between S. macedonicus and L. lactis was created. This fact enhances the likelihood that S. macedonicus acquired this plasmid from L. lactis. With this study are provided the first molecular and evolutionary evidence for the habituation of S. macedonicus to the dairy environment.