Επιλογή στελεχών μυκήτων και ζυμών προς βιοτεχνολογική παραγωγή δευτερογενών μικροβιακών μεταβολιτών

Abstract

Η παρούσα μελέτη εκπονήθηκε σε δύο στάδια με σκοπό την μελέτη στελεχών μυκήτων και την επιλογή ζυμομυκήτων προς βιοτεχνολογική παραγωγή δευτερογενών μεταβολιτών κυρίως οργανικών οξέων και μικροβιακού λίπους. Κατά το πρώτο στάδιο μελετήθηκε η βιοχημική παραγωγή φουμαρικού οξέος με τη χρήση μυκήτων που ανήκουν στο γένος Rhizopus, και συγκεκριμένα των στελεχών Rhizopus delemar NRRL 1472, Rhizopus oryzae NRRL 1526, Rhizopus arrhizus NRRL 2582, Rhizopus oryzae NRRL 3562 και Rhizopus oryzae NRRL 3563. Τα υποστρώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν εμπορική σακχαρόζη, ισομοριακό μείγμα γλυκόζης: φρουκτόζης, μελάσα, χημικώς υδρολυμένη μελάσα και γλεκερόλη. Κατά τη διεξαγωγή της πειραματικής διαδικασίας μόνο το στέλεχος R. arrhizus NRRL 2582 παρουσίασε αύξηση στη βιομάζα και παραγωγή φουμαρικού οξέος στα υποστρώματα σακχαρόζης και μελάσας γεγονός το οποίο οφείλεται στην παρουσία του ενζύμου ιμβερτάσης. Συγκεκριμένα, η καλλιέργεια του εν λόγω στελέχους σε υπόστρωμα αρχικής συγκέντρωση σακχαρόζης 50 g•L-1 η παραγωγή φουμαρικού οξέος ήταν 12,8 g•L-1. Αντιθέτως, κατά την καλλιέργεια του μύκητα σε μελάσα με αρχική συγκέντρωση 50 g•L-1 δεν αναπτύχθηκε, ενώ σε συγκέντρωση 25 g•L-1 η παραγωγή φουμαρικού οξέος ήταν 5,1 g•L-1. Η μελέτη των στελεχών Rhizopus σε ισομοριακό μείγμα γλυκόζης: φρουκτόζης διεξήχθη σε δύο συγκεντρώσεις 25 και 50 g•L-1. Όλα τα στελέχη Rhizopus, εκτός από το R. delemar NRRL 1472, παρουσίασαν αύξηση και παραγωγή φουμαρικού οξέος. Στο ισομοριακό μείγμα γλυκόζης:φρουκτόζης αρχικής συγκέντρωσης 25 g•L-1 σημείωσαν υψηλότερη απόδοση παραγόμενου προϊόντος, ενώ στο υπόστρωμα με αρχική συγκέντρωση 50 g•L-1 παρατηρήθηκε υψηλότερη συγκέντρωση φουμαρικού οξέος. Ειδικότερα, τα στελέχη R. oryzae NRRL 1526, R. arrhizus NRRL 2582, R. oryzae NRRL 3562 και R. oryzae NRRL 3563 στο υπόστρωμα αρχικής συγκέντρωσης 25 g•L-1 παρήγαγαν 12, 12,1, 9,4 και 8,9 g•L-1 φουμαρικό οξύ με συντελεστές απόδοσης 0,59, 0,63, 0,39, 0,39 g•g-1 αντίστοιχα, ενώ στο υπόστρωμα αρχικής συγκέντρωσης 50 g•L-1 η συγκέντρωση φουμαρικού οξέος ήταν 15,9, 13,1, 4,2 και 11,2 g•L-1 με συντελεστές απόδοσης 0,36, 0,28, 0,15 και 0,22 g•g-1αντίστοιχα. Τέλος, μελετήθηκε η δυνατότητα παραγωγής φουμαρικού οξέος με το στέλεχος R. oryzae NRRL 1526 σε χημικώς υδρολυμένη μελάσα αρχικής συγκέντρωσης 25 g•L-1 και τα στελέχη Rhizopus σε γλυκερόλη 20 g•L-1, αλλά κανένα από τα στελέχη δεν σημείωσε αύξηση και παραγωγή φουμαρικού οξεός. Κατά το δεύτερο στάδιο απομονώθηκαν και μελετήθηκαν στελέχη ζυμών για την παραγωγή οργανικών οξέων, κυρίως μηλικού, κιτρικού, ηλεκτρικού και φουμαρικού, καθώς και την παραγωγή μικροβιακού λίπους. Για την παραγωγή οργανικών οξέων, 35 στελέχη ζυμών απομονώθηκαν και επιλέχθηκαν για περαιτέρω μελέτη. Κατά την καλλιέργεια των στελεχών ζυμών σε υπόστρωμα γλυκόζης αρχικής συγκέντρωσης 40 g•L-1 σημειώθηκε παραγωγή κιτρικού οξέος (3,56- 7,85 g•L-1) ως κύριο μεταβολικό προϊόν από 5 στελέχη ζυμών. Επιπλέον, δύο στελέχη ζυμών που απομονώθηκαν από το φραγκόσυκο με κωδική ονομασία ΟFI_C1 και OFI_C2 σημείωσαν παραγωγή μηλικού οξέος με συγκέντρωση 4,09 και 1,43 g•L-1 αντίστοιχα. Η παραγωγή ηλεκτρικού οξέος παρατηρήθηκε σε χαμηλές συγκεντρώσεις, ωστόσο σημειώθηκε ως κύριο μεταβολικό προϊόν σε ένα στέλεχος που απομονώθηκε από τη βανίλια (Prunus domestica). Όσο αφορά την μελέτη παραγωγής μικροβιακού λίπους, 51 στελέχη ζυμών απομονώθηκαν εκ των οποίων 24 είχαν τη δυνατότητα συσσώρευσης ενδοκυτταρικού λίπους μεγαλύτερη από 20% w/w. Από αυτά τα στελέχη 6 στελέχη ζυμών μελετήθηκαν περαιτέρω και ταυτοποιήθηκαν. Συγκεκριμένα, διερευνήθηκε σε πρωταρχικό στάδιο η δυνατότητα παραγωγής μικροβιακού λίπους σε υπόστρωμα σακχαρόζης αρχικής συγκέντρωσης 20 και 100 g•L-1. Κατά την καλλιέργεια των στελεχών σε σακχαρόζη αρχικής συγκέντρωσης 20 g•L-1 , η παραγωγή μικροβιακού λίπους κυμάνθηκε από 24- 30 %. Ωστόσο, στην υψηλότερη συγκέντρωση σακχάρων, όλα τα στελέχη ζυμών, εκτός από το στέλεχος που απομονώθηκε από το σταφύλι (Vitis vinifera) με κωδική ονομασία VV_D4, παρουσίασαν μείωση παραγωγής λίπους με ταυτόχρονη παραγωγή κιτρικού οξέος και αιθανόλης.

The aim of the present study was to evaluate fumaric acid production from 5 different Rhizopus strains and isolate yeast strains for the potential production of secondary metabolites, mainly organic acids and microbial oil. Screening of fungi and yeast strains, was conducted in two stages. In the first stage we investigated the biochemical conversion of raw materials and commercial sugars, as carbon source, using Rhizopus delemar NRRL 1472, Rhizopus oryzae NRRL 1526, Rhizopus arrhizus NRRL 2582, Rhizopus oryzae NRRL 35262 and Rhizopus oryzae NRRL 3563 for the production of fumaric acid. The substrates investigated for this purpose were commercial sucrose, equimolar mixture of glucose and fructose, cane molasses, chemical hydrolyzed cane molasses and glycerol. In the case of commercial sucrose and cane molasses, only R. arrhizus NRRL 2582 was able to produce fumaric acid. Specifically, the recorded fumaric acid production of R. arrhizus NRRL 2582 on sucrose (50 g•L-1) was 12.8 g•L-1. During fermentation on cane molasses with initial concentration of 50 g•L-1 sugars (as glucose equivalents) R. arrhizus NRRL 2582 did not show any growth, while on 25g•L-1 the production of fumaric acid was 5.1g•L-1. Fermentations of Rhizopus strains on equimolar mixture of glucose and fructose were performed using 25 and 50g•L-1 total sugars. All Rhizopus strains achieved maximum yield on 25g•L-1, and highest production of fumaric acid was observed on 50 g•L-1, while R. delemar NRRL 1472 did not grow on any of the substrates used. In particular, the higher concentrations of fumaric acid on equimolar mixture of glucose:fructose with initial concentration of sugars 25 g•L-1by R. oryzae NRRL 1526, R. arrhizus NRRL 2582, R. oryzae NRRL 3562 and R. oryzae NRRL 3563 were 12, 12.1, 9.4 and 8.9 g•L-1 with a yield of 0.59, 0.63, 0.39, 0.39 g•g-1, respectively, while on the substrate with initial concentration of sugars 50 g•L-1 fumaric acid production was 15.9, 13.1, 4.2 and 11.2 g•L-1 with a yield of 0.36, 0.28, 0.15 and 0.22 g•g-1, respectively. The potential of fumaric acid production by R. oryzae NRRL 1526 strain was studied on chemical hydrolysed cane molasses in concentration of 25g•L-1 (as glucose equivalents) and on glycerol in 20 g•L-1 concentration was examined by all Rhizopus strains. Results showed that these substrates were not suitable for fumaric acid production. In the second stage we isolated yeast strains for the potential production of organic acids, mainly malic, citric, succinic and fumaric acid and for the accumulation of microbial oil. For the production of organic acids, 35 isolates which indicate a desirable product were selected for further analysis. During fermentation of yeast strains on glucose 40 g•L-1, citric acid production was recorded (3.56-7.85 g•L-1) as main product by 5 isolates. Moreover, two yeast strains which were isolated from prickly pear (Opuntia ficus indica) with the code name OFI_C1 and OFI_C2 could produce malic acid in concentrations of 4.09 and 1.43 g•L-1, respectively. Succinic acid production was relatively low, but it was observed as a main product by one of the strains isolated from plum (Prunus domestica). For the production of microbial oil, we isolated 51 yeast colonies, 24 of which could produce microbial oil more than 20% w/w lipid content in dry biomass. The best results were obtained by 6 isolated and were further studied in shake flask fermentations and were classified using 26S rRNA sequence. In particularly, we investigated their ability to accumulate lipid on sucrose with initial concentrations of 20 and 100 g•L-1. Lipid was produced in amounts ranging from 24 to 30% w/w in sucrose concentration of 20 g•L-1. Higher concentration (100 g•L-1) of sucrose did not improve lipid accumulation, except for one isolate from grape (Vitis vinifera) with the code name VV_D4, with simultaneous production of citric acid and ethanol.