Μελέτη των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων που εμπλέκονται στην οφθαλμόπτωση στη φιστικιά

Abstract

Η Ελλάδα κατέχει την έκτη θέση στην παραγωγή φιστικιών σε παγκόσμιο επίπεδο ενώ η καλλιέργεια της φιστικιάς (Pistacia vera L.) προσφέρει σημαντική οικονομική πρόσοδο στους παραγωγούς. Ένα από τα σημαντικότερα χαρακτηριστικά της καλλιέργειας είναι η υψηλής έντασης παρενιαυτοφορία. Η παρενιαυτοφορία στη φιστικιά εκδηλώνεται με το μηχανισμό της φυσιολογικής οφθαλμόπτωσης η οποία θεωρείται φαινόμενο σημαντικής οικονομικής σημασίας και συνίσταται στην πτώση ανθοφόρων οφθαλμών από βλαστούς τρέχουσας εποχής που φέρονται σε καρποφορούντες βραχίονες. Η περίοδος επαγωγής του σήματος της οφθαλμόπτωσης εντοπίζεται χρονικά το καλοκαίρι του έτους καρποφορίας κατά την περίοδο της ταχείας πλήρωσης του ενδοκαρπίου. Παρά την σημασία της, δεν έχει διευκρινηστεί ακόμη ούτε το κύριο αίτιο που την προκαλεί ούτε ο μηχανισμός εκδηλωσής της. Στα πλαίσια της πτυχιακής εργασίας επιχειρήθηκε ανίχνευση διαφορών στη γονιδιακή έκφρασης μεταξύ ανθοφόρων οφθαλμών από βλαστούς καρποφορούντων βραχιόνων (ΟΝ) και ανθοφόρων οφθαλμών από βλαστούς μη καρποφορούντων βραχιόνων (OFF) στη φιστικιά, κατά την περίοδο της επαγωγής του σήματος της οφθαλμόπτωσης της φιστικιάς. Προς τούτο, συλλέχθηκε φυτικό υλικό υλικό που το απετέλεσαν ON και OFF ανθοφόροι οφθαλμοί δένδρου ποικιλίας “Pontikis” και πραγματοπιήθηκαν δύο μοριακές αφαιρέσεις μεταγραφημάτων (mRNA) με τη χρήση του κατασταλτικού αφαιρετικού υβριδισμού (suppression subtractive hybridization, SSH). Η μια αφαίρεση ήταν η ΟΝ-OFF ενώ η δεύτερη ήταν η αντίθετη, ήτοι OFF-ON. Από τη διαδικασία του κατασταλτικού αφαιρετικού υβριδισμού παρατηρήθηκαν διαφορές στη γονιδιακή έκφραση μεταξύ των δύο κατηγοριών ανθοφόρων οφθαλμών, οι οποίες πιθανόν να σχετίζονται με το φαινόμενο της οφθαλμόπτωσης στη φιστικιά. Ο σκοπός της παρούσας μεταπτυχιακής ερευνητικής εργασίας ήταν η σύγκριση μεταξύ μεταγραφημάτων γονιδίων τα οποία εκφράζονται σε ΟΝ και OFF οφθαλμούς φιστικιάς. Aπό τα αποτελέσματα του κατασταλτικού αφαιρετικού υβριδισμού δημιουργήθηκαν δύο αφαιρετικές cDNA βιβλιοθήκες: ON-OFF και OFF-ON. H πρώτη περιείχε τα γονίδια τα οποία εκφράζονται σε οφθαλμούς οι οποίοι φέρονταν σε βλαστούς καρποφορούντων βραχιόνων ενώ η δεύτερη σε οφθαλμούς βλαστών οι οποίοι φέρονταν σε μη καρποφορούντες βραχίονες. Έπειτα, πραγματοποιήθηκε κλωνοποίηση των διαφορικά εκφραζόμενων cDNA και μετασχηματισμός επιδεκτικών βακτηριακών κυττάρων Escherichia coli. Ακολούθησε επιλογή βακτηριακών αποικιών, η αναπτυξή τους σε υγρό θρεπτικό μέσο, η απομόνωση του πλασμιδιακού τους DNA και η αποστολή του για αλληλούχηση. Οι αποκτηθείσες αλληλουχίες επεξεργάστηκαν με το πρόγραμμα VecScreen (NCBI), ενώ στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε έλεγχος για τον εντοπισμό όμοιων αλληλουχιών μεταξύ των αποκτηθεισών με το πρόγραμμα StandAlone BLAST (NCBI). Ακολούθησε η πολλαπλή συστοίχηση των όμοιων αλληλουχιών με το λογισμικό ClustalW2 (EBI). Συνολικά ανακτήθηκαν 32 αλληλουχίες ενθεμάτων πλασμιδίων 12 από τη μοριακή αφαιρέση ON-OFF και 20 από τη μοριακή αφαίρεση OFF-ON. Τέλος, πραγματοποιήθηκε σύγκριση των αλληλουχιών που ανακτήθηκαν με τη χρήση του διαδικτυακού λογισμικού BLAST (NCBI) με τις αλληλουχίες που είναι κατάτεθημένες στις βάσεις δεδομένων των φυτών για τις πρωτεΐνες (blastx), τα νουκλεοτίδια (blastn) και για τα ESTs (Blastn-EST) καθώς επίσης και η κατηγοριοποίηση των ESTs σε κατηγορίες λειτουργιών γονιδίων σύμφωνα με το πρόγραμμα Blast2GO. Από την σύγκριση των αποκτηθέντων αλληλουχιών γονιδίων για τους ΟΝ οφθαλμούς με τις αλληλουχίες που είναι κατατεθειμένες στις βάσεις δεδομένων προέκυψε ότι υπάρχει ομολογία με γονίδια τα οποία εμπλέκονται στην άμυνα του φυτού, σε αβιοτικές και βιοτικές καταπονήσεις, στον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο (Π.Κ.Θ.) και τη μετάδοση σημάτων. Όσο αφορά τις αλληλουχίες των OFF οφθαλμών, βρέθηκε ομολογία με γονίδια τα οποία εκφράζονται σε καταστάσεις βιοτικών και αβιοτικών καταπονήσέων και γονιδίων τα οποία εκφράζονται ύστερα από επεμβάσεις με διάφορες ουσίες π.χ. κυαναμίδη, λαμιναρίνη και σαλικυλικό οξύ. Τέλος, βρέθηκε ομολογία με γονίδια τα οποίας σχετίζονται με αναπτυξιακές διαδικασίες, με το μεταβολισμό (βασικό και δευτερογενή), τη μεταφορά νερού στο κύτταρο, και τη μετάδοση σημάτων.

Hellas occupies the sixth position in the production of pistachio nuts worldwide. Alternate bearing in pistachio tree (Pistacia vera L.) is considered as a phenomenon of great commercial importance and is caused by bud abscission. However, the primary cause of this apoptotic phenomenon remains unknown despite its great importance. In my undergraduate study (Tsafouros, 2010) the period of the bud abscission signal induction was determined and coincided with the period of fast kernel’s development. In addition, the molecular isolation of genes involved in the alternate bearing phenomenon in pistachio by detecting the differences in the molecular expression between buds located on fruit-bearing (ON) and non fruit-bearing (OFF) branches during the period of the bud abscission signal induction was performed by suppression subtractive hybridization (SSH). The differences in gene expression that were detected were thought to be related with the bud abscission phenomenon and thus needed further study. The aim of this study leading to MSc was the comparison between transcripts that are expressed in the “ON” and “OFF” pistachio buds in order to identify the differentially expressed genes. During the SSH two subtractive cDNA libraries were created: ON-OFF and OFF-ON. The first library contained transcripts that are expressed in ON buds, whereas the second one contained transcripts that are expressed in OFF buds. Cloning of the differentially expressed cDNAs, E. coli transformation, bacterial colony selection and plasmid DNA isolation were performed before DNAs were sent for sequencing. The acquired sequences were edited with VecScreen (NCBI) followed by detection of the similar sequences between the acquired using StandAlone BLAST (NCBI) and multiple alignment with the ClustalW2 (EBI). The total number of the acquired sequences was 32; 12 for the molecular subtraction ON-OFF and 20 for the molecular subtraction OFF-ON. Bioinformatics similarity analyses for the obtained cDNA sequences (ESTs) was performed by comparison with nonredundant protein, nucleotide and EST databases using BlastX, BlastN and Blast-EST searches provided through the NCBI database. Finally, categorization of the ESTs in gene functional categories with the software Blast2GO was held. The results of the cDNA sequences similarity analyses for the ON bud sequences indicated homology with genes that are involved in plant defense, in biotic and abiotic stresses, signal transduction and the programmed cell death (PCD). Concerning the OFF bud sequences the similarity analyses indicated homology with genes which are expressed after treatment with cyanamide, laminarine and salicylic acid, genes involved in plant defense, abiotic and biotic stresses, genes which are related with metabolic processes, water transportation and signal transduction. Confirmation of the results will be done by real time RT-PCR (gene expression) and further study of selected genes will follow.