Διερεύνηση του ρόλου του συζευγμένου πρωτεϊνικού υποδοχέα VdSteA στην παθογένεια και βιολογία του φυτοπαθογόνου μύκητα V. dahliae

Abstract

Η αδρομύκωση που προκαλείται από τον εδαφογενή, φυτοπαθογόνο μύκητα Verticillium dahliae (Αδηλομύκητας) είναι μια δύσκολα ελεγχόμενη και καταστροφική ασθένεια για ένα μεγάλο εύρος ποωδών και ξυλωδών φυτών, επειδή προσβάλλει τους αγγειώδεις ιστούς των φυτών. Η αδυναμία επιτυχούς αντιμετώπισης της ασθένειας οφείλεται στην ικανότητα του μύκητα να επιβιώνει στο έδαφος για μεγάλες χρονικές περιόδους με ή χωρίς την παρουσία φυτού ξενιστή και στο γεγονός ότι αποικίζει τα αγγεία του ξύλου εντός του φυτού. Επιπλέον δεν υπάρχουν χημικά μέσα για τον έλεγχο της ασθένειας, ενώ το παθογόνο μπορεί να μεταδοθεί με αρκετούς τρόπους. Στα πλαίσια της παρούσας μεταπτυχιακής μελέτης πραγματοποιήθηκε γονιδιωματική πρόβλεψη και φυλογενετική ανάλυση των συζευγμένων πρωτεϊνικών υποδοχέων με τις G πρωτεϊνες (GPCRs) στο μύκητα Verticillium dahliae. Στη συνέχεια έγινε επιλογή του γονιδίου ενός GPCR, που λειτουργεί ως φερομονικός υποδοχέας Ste2, και αφού πραγματοποιήθηκε η απενεργοποίηση του διερευνήθηκε ο ρόλος του στην παθογένεια και βιολογία του φυτοπαθογόνου μύκητα V. dahliae. Οι συζευγμένοι πρωτεϊνικοί υποδοχείς με τις G πρωτεϊνες ή GPCRs αντιπροσωπεύουν τη μεγαλύτερη οικογένεια διαμεμβρανικών υποδοχέων και είναι υπεύθυνοι για τη μετάδοση εξωκυτταρικών σημάτων σε ενδοκυττάρια συστήματα απόκρισης σε ποικίλα ερεθίσματα όπως φως, πρωτόνια, Ca2+, πτητικές ουσίες, φερομόνες, αμινοξέα, νουκλεοτίδια, πρωτεΐνες, πεπτίδια, στεροειδή και λιπαρά οξέα. Ως φερομόνες ορίζονται οι ουσίες που διευκολύνουν την επικοινωνία ή την αναπαραγωγή μεταξύ των ατόμων του ιδίου είδους και οι φυσιολογικές αντιδράσεις ή οι συμπεριφορές συχνά αλλάζουν όταν ένα άτομο αντιλαμβάνεται μια φερομόνη. Στους ασκομύκητες και τους βασιδιομύκητες, οι φερομόνες ανιχνεύονται από υποδοχείς φερομονών, οι οποίοι είναι GPCRs με 7 διαμεμβρανικές περιοχές. Αυτοί οι υποδοχείς ενεργοποιούνται με τη σύνδεση της φερομόνης και εκκινούν τα καθοδικά μονοπάτια μεταγωγής σήματος ώστε να επιτευχθεί η σύζευξη. Στις δεκαετίες του 1970 και 1980 ανακαλύφθηκε μια ομάδα «στείρων» γονιδίων (Sterile genes, Ste), οι μεταλλάξεις των οποίων είχαν σαν αποτέλεσμα στείρους φαινοτύπους. Από αυτά τα STE γονίδια, τα STE2 και STE3 είναι υποδοχείς υπεύθυνοι για την αντίληψη των φερομονών. Από τα αποτελέσματα της βιοπληροφορικής ανάλυσης στο μύκητα V. dahliae προέκυψαν 15 γονίδια GPCR, τα οποία ομαδοποιήθηκαν με βάση το ερέθισμα το οποίο λαμβάνουν σε 7 κατηγορίες: Θεωρητικός υποδοχέας θρεπτικών στοιχείων (2 γονίδια GPCR), GPCRs περιέχουν περιοχή HlyIII (1 γονίδιο GPCR), Υποδοχέας άνθρακα/αζώτου (2 γονίδια GPCR), Υποδοχέας Ste2 (1 γονίδιο GPCR), Υποδοχέας Pth11 (5 γονίδια GPCR), Υποδοχέας cAMP (3 γονίδια GPCR) και Υποδοχέας μικροβιακής οψίνης (1 γονίδιο GPCR). Στη συνέχεια, κατασκευάστηκε αλληλόμορφος αντικατάστασης για το γονίδιο VdSteA, ο οποίος ενσωματώθηκε στο γονιδίωμα της φυλής 1 της τομάτας 70V και της μη αποφυλλωτικής φυλής του βαμβακιού 25V με τη βοήθεια του βακτηρίου Agrobacterium tumefaciens. Το γονίδιο VdSteA αντικαταστάθηκε από το γονίδιο ανθεκτικότητας στο αντιβιοτικό γενετισίνη. Στις δοκιμές παθογένειας που πραγματοποιήθηκαν σε φυτά μελιτζάνας και τομάτας βρέθηκε ότι τα μεταλλαγμένα ΔVdSteA στελέχη του 70V προκαλούν τυπικά συμπτώματα σε φυτά τομάτας και μελιτζάνας, ωστόσο η σοβαρότητα της ασθένειας ήταν στατιστικά μειωμένη σε σχέση με το άγριο στέλεχος σε φυτά μελιτζάνας, ενώ σε φυτά τομάτας τα μεταλλαγμένα ΔVdSteA στελέχη παρουσίασαν τάση για διαφοροποιημένη μείωση της δριμύτητας της ασθένειας. Στην περίπτωση των μεταλλαγμένων ΔVdSteA στελεχών του 25V παρατηρήθηκε στατιστικά μειωμένη δριμύτητα της ασθένειας σε σχέση με το άγριο στέλεχος τόσο σε φυτά μελιτζάνας όσο και σε φυτά τομάτας. Τα μεταλλαγμένα ΔVdSteA του 70V και του 25V χαρακτηρίστηκαν επίσης ως προς τη μυκηλιακή αύξηση και το σχηματισμό μικροσκληρωτίων. Διαπιστώθηκε στατιστικά μειωμένη ανάπτυξη αποικίας στα ΔVdSteA του 70V έναντι της άγριας φυλής αλλά όχι στατιστική διαφορά ως προς το σχηματισμό μικροσκληρωτίων. Στην περίπτωση του 25V δεν παρατηρήθηκε διαφοροποίηση με τα μεταλλαγμένα ΔVdSteA στελέχη ως προς την αύξηση της διαμέτρου της αποικίας, αλλά τα ΔVdSteA στελέχη παρουσίασαν μειωμένη ανάπτυξη μικροσκληρωτίων έναντι της άγριας φυλής. Συγκρίθηκε, επιπλέον, η κονιδιοποίηση και η παραγωγή μικροσκληρωτίων μεταξύ των άγριων φυλών 70V και 25V και των αντίστοιχων μεταλλαγμένων ΔVdSteA στελεχών τους. Διαπιστώθηκε αυξημένη κονιδιοποίηση αλλά και σχηματισμός μικροσκληρωτίων στα ΔVdSteA στελέχη έναντι της άγριας φυλής 70V, ενώ στην περίπτωση του 25V δεν παρατηρήθηκε στατιστική διαφοροποίηση με τα ΔVdSteA στελέχη του ούτε όσον αφορά την κονιδιοποίηση ούτε όσον αφορά την παραγωγή μικροσκληρωτίων. Τέλος η μελέτη του ρυθμού βλαστικότητας των ΔVdSteA στελεχών και των άγριων φυλών 70V και 25V έδειξε ότι τα μεταλλαγμένα στελέχη και των δύο φυλών παρουσίασαν στατιστικά υψηλότερα επίπεδα βλαστικότητας σε σχέση με τα άγρια στελέχη τους στα χρονικά διαστήματα στα οποία πραγματοποιήθηκε μέτρηση. Τα ευρήματα της παρούσας μελέτης σε συνδυασμό με αποτελέσματα άλλων μελετών που έχουν πραγματοποιηθεί πάνω στην αλληλεπίδραση του μύκητα V. dahliae με τους ξενιστές του (Pantelides et al. 2010, Tzima et al. 2010, Tzima et al. 2011, Tzima et al. 2012) μπορούν να συμβάλουν στην κατανόηση των μονοπατιών που ρυθμίζουν σε μεταβολικό και κυτταρικό επίπεδο την παθογένεια και τη βιολογία του φυτοπαθογόνου αυτού μύκητα. Αυτή η κατανόηση μπορεί να οδηγήσει στο σχεδιασμό στρατηγικών αποτελεσματικής αντιμετώπισης ενός παθογόνου που δεν αντιμετωπίζεται με συμβατικά μέσα.

The particular biology of this fungus complicates its treatment through conventional methods. Thus, the study of genes implicated in interactions of the fungus with its hosts is necessary to unravel the pathogenicity or virulence mechanisms and to discover putative novel methods to control the disease. G Protein-Coupled Receptors (GPCRs) represent the largest family of transmembrane receptors consisting of seven transmembrane domains. GPCRs are critical factors in regulating morphogenesis, defense, mating, infection and virulence in various organisms. Protein sequences of characterized GPCRs of the well studied fungi Aspergillus nidulans and Magnaporthe grisea were used for alignment comparison with the genome of V. dahliae, in order to detect potential GPCRs. After performing phylogenetic analysis, the sequences of V. dahliae that showed high homology to the GPCRs of A. nidulans and M. grisea were selected in order to sort out the receptors by their molecular relativity. Seven different groups of GPCRs emerged from the phylogenetic analysis, varying in sensing different environmental signals. Agrobacterium mediated disruption of a pheromone GPCR (named as VdSteA) in two wild races, 70V and 25V of V. dahliae was performed in order to study the role of this receptor in virulence and morphology. 70V and 25V ΔVdSteA mutants displayed reduction in virulence in eggplants and tomato plants and 70V ΔVdSteA mutants exhibited increased microsclerotia formation and conidiation compared to their corresponding wild types. Both ΔVdSteA mutants exhibited higher conidial germination rates compared to the wild types.