Διερεύνηση της μικροχλωρίδας της στάκας. Ταυτοποίηση βακτηρίων με την πρωτεομική τεχνολογία της φασματομετρίας μαζών

Abstract

Η παρούσα μελέτη αφορά στη διερεύνηση της μικροχλωρίδας της Στάκας, ενός παραδοσιακού γαλακτοκομικού προϊόντος της Κρήτης, και στην ταυτοποίηση των απομονωθέντων βακτηρίων με την πρωτεωμική τεχνολογία της Φασματοσκοπίας Μαζών, και συγκεκριμένα της μεθόδου Maldi-TOF MS (matrix assisted laser desorption/ionization – Time Of Flight – Mass Spectroscopy) Από τα δείγματα του τυριού απομονώθηκαν 106 ‘άγρια’ στελέχη οξυγαλακτικών βακτηρίων, τα οποία αρχικά χαρακτηρίστηκαν και ομαδοποιήθηκαν με φαινοτυπικές μεθόδους. Για την ταυτοποίηση με τη μέθοδο Maldi-TOF MS, έγιναν διαδοχικές ανακαλλιέργειες των βακτηριακών στελεχών μέχρι την 3η γενιά, λύση των κυττάρων και συλλογή των κυτταρικών πρωτεϊνών. Στη συνέχεια, οι πρωτεΐνες ενσωματώθηκαν με περίσσεια υποστρώματος (matrix) και εισήχθησαν στο φασματογράφο όπου ιονίσθηκαν με παλμούς lazer. Κάθε στέλεχος έδωσε ένα διακριτό φάσμα μαζών. Η τελική ανάλυση των παραγόμενων φασμάτων μάζας έγινε με εργαλεία Βιοπληροφορικής. Συγκεκριμένα χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό Bionumerics (Applied Maths) και εφαρμόστηκε η στατιστική μέθοδος Ανάλυση κατά Συστάδες με τη μέθοδο ομαδοποίησης μη σταθμισμένων ζευγών (UPGMA, Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic Μean). Για τη φυλογενετική ταξινόμηση, χρησιμοποιήθηκε η βάση δεδομένων του Εργαστηρίου Μικροβιολογίας του Πανεπιστημίου της Γάνδης (LMG, Βέλγιο) που περιλαμβάνει περί τα 30.000 φάσματα μικροοργανισμών. Για τα στελέχη για τα οποία η Μaldi-TOF MS δεν έδωσε σαφή αποτελέσματα χρησιμοποιήθηκαν οι τεχνικές αλληλούχησης του γονιδίου του ενζύμου PheS και αλληλούχησης γονιδίου 16S rRNA. Συνολικά ταυτοποιήθηκαν 101 από τα 106 απομονωθέντα στελέχη. Αναγνωρίστηκαν 9 διαφορετικά είδη οξυγαλακτικών βακτηρίων: L. plantarum (24), L. paraplantarum (10), L. paracasei (20), E.durans (21), E. Faecalis (11), E. Faecium (2), S. thermophilus (8), Aerococcus sp. (1).

This study concerns the exploration of microbiota of Staka, which is is a peculiar dairy product prepared in Crete, and the identification of bacterial isolates using the Proteomic technology of Mass Spectrometry. From these cheese samples a total of 106 wild lactic acid bacteria were isolated and phenotypically characterized. Lactobacilli were the most abundant group. For the sample preparation the bacterial strains submitted to successive revivals until their 3rd gen. Firstly performed cell lysis and then proteins extraction. The bacterial samples analyzed by Maldi-TOF MS. The protein’s molecules are mixed with the matrix solution, introduced in the vacuum area into mass spectrometer and exposed to a laser beam. Each strain gave transmitted a unique signal. The final analysis of the above mass spectra took place with Bioinformatics’ tools. We used Bionumerics (Applied Maths) software in which applied Cluster Analysis according to UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic Μean). Concerning the Phylogenetic taxonomy, spectras compared to each other and classified hierarchically according to mass signal and intense and creating dendrograms. For the identifications the same software had been used with specific algorithm and the resulting fingerprints were compared with the approximately 30000 entries of LMG’s lab (University of Gent, Belgium). The strains, for which Maldi-TOF MS didn’t give clear taxonomy, were identified through PheS and 16SrRNA gene sequence analysis. They were identified 101 for 106 isolated strains, from which 9 different species of lactic acid bacteria occurred. L. plantarum (24), L. paraplantarum (10), L. paracasei (20), E.durans (21), E. Faecalis (11), E. Faecium (2), S. thermophilus (8), Aerococcus sp. (1).