The antioxidant effect of dietary micro algae supplementation on milk, blood and rumen of dairy goats

Abstract

Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν να μελετήσει δύο στελέχη πράσινων φυκιών του είδους Chrorella (C. pyrenoidosa και C. vulgaris) ως μία φυσική πηγή αντιοξειδωτικών σε αίγες γαλακτοπαραγωγής και να διερευνήσει την επίδρασή τους: στην ενζυμική δραστηριότητα αντιοξειδωτικών ενζύμων στο πλάσμα του αίματος και στο γάλα, στο προφίλ των λιπαρών οξέων στο πλάσμα του αίματος, στο γάλα και στο υγρό της μεγάλης κοιλίας, στην ενζυμική δραστικότητα των ενζύμων της μεγάλης κοιλίας και στην μικροβιακή κοινότητα της μεγάλης κοιλίας, μέσω qΡCR. Η μελέτη αποτελείται από δύο κύρια πειράματα. Το πρώτο πείραμα διεξήχθη, για 4 εβδομάδες, με δεκαέξι γαλακτοπαραγωγές αίγες φυλής Alpine οι οποίες κατανεμήθηκαν σε δύο ομάδες (CON = μάρτυρας και ALG = επέμβαση) των οκτώ αιγών. Η ομάδα CON έλαβε ένα σιτηρέσιο χωρίς μικροφύκη, ενώ στην ομάδα ALG, 10g C. pyrenoidosa / kg ενσωματώθηκαν στο προς χορήγηση σιτηρέσιο. Η σίτιση των αιγών βασίστηκε στις χονδροειδείς ζωοτροφές, άχυρο σίτου και σανό μηδικής και σε ένα μίγμα συμπυκνωμένων ζωοτροφών σύμφωνο με τις απαιτήσεις τους. Δείγματα γάλακτος συλλέχθηκαν σε εβδομαδιαία βάση για χημική ανάλυση. Δείγματα γάλακτος και αίματος συλλέχθηκαν επίσης ανά περίοδο δύο εβδομάδων για τον προσδιορισμό της δραστικότητας των ενζύμων CAT, LΡΟ, GST, GSH-Px, GR και SOD, καθώς και του προφίλ των λιπαρών οξέων. Την τελευταία ημέρα του πειράματος, συλλέχθηκαν δείγματα υγρού μεγάλης κοιλίας, με έναν στομαχικό σωλήνα, 3 ώρες μετά την πρωινή διατροφή και καταψύχθηκαν στους -80 ο C για ανάλυση των λιπαρών οξέων των προστομάχων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η συμπλήρωση της διατροφής των αιγών με C. pyrenoidosa παρουσίασε: α) αυξημένη ενεργότητα (U/ml) στα ένζυμα GR (P<0,05) και SOD (P<0,01), αυξημένη (P<0.01) συγκέντρωση πρωτεΐνης (σε mg/ml) στο πλάσμα του αίματος, και μειωμένη (P<0,01) δραστικότητα του ενζύμου GSH-Ρχ (σε U/ml) στο γάλα σε σύγκριση με εκείνα της ομάδας CON. β) καμία επίδραση στην απόδοση και τη χημική σύνθεση του γάλακτος, ενώ υπήρξε μια στατιστικώς σημαντική αύξηση (P<0,05) της συγκέντρωσης των C18:1 trans και μείωση (P>0,05) της συγκέντρωσης των μικρής αλύσου κορεσμένων λιπαρών οξέων γ) αύξηση (Ρ< 0,05) της συσσώρευσης του C18:0 και μείωση των ενδιάμεσων μορφών , των MUFA και του λόγου C14:1/C 14:0 (Ρ< 0,05), στο υγρό της μεγάλης κοιλίας και δ) μείωση (Ρ< 0,05) των συγκεντρώσεων των ακόλουθων λιπαρών οξέων στο πλάσμα του αίματος: C18:2η-6 trans, C18:3n-6, C20:1, C21:0, C20:2 και C20:4. Το δεύτερο πείραμα διεξήχθη με δεκαέξι αίγες φυλής Alpine που κατανεμήθηκαν σε δύο ομάδες (CON = μάρτυρας και ALG = επέμβαση) των οκτώ αίγων, για 4 εβδομάδες. Η ομάδα CON έλαβε μία δίαιτα χωρίς μικροφύκη ενώ στην ομάδα ALG, 10g C. vulgaris/kg ενσωματώθηκαν στο σιτηρέσιο. Η διατροφή των αιγών βασίστηκε σε χόρτο ψυχανθών, σανό μηδικής ως πηγή χονδροειδών ζωοτροφών, και ένα μίγμα συμπυκνωμένων ζωοτροφών σύμφωνο με τις απαιτήσεις τους. Δείγματα γάλακτος συλλέχθηκαν εβδομαδιαίως για χημική ανάλυση. Δείγματα αίματος και γάλακτος συλλέχθηκαν επίσης κάθε δύο εβδομάδες για να προσδιοριστεί η δραστικότητα των ενζύμων CAT, LPO, GST, GSH-Ρx, GR, SOD καθώς και το προφίλ των λιπαρών οξέων. Την τελευταία ημέρα του πειράματος, συλλέχθηκε υγρό μεγάλης κοιλίας, με ένα σωλήνα, 3 ώρες μετά την πρωινή διατροφή, το οποίο μετά από διήθηση καταψύχθηκε στους - 80° C. Μέρος του υγρού κρατήθηκε χωρίς διήθηση και καταψύχθηκε στους -80 ° C για ανάλυση q-PCR. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η συμπλήρωση της διατροφής των αιγών με 10g/kg C. vulgaris παρουσίασε α) αυξημένη ενεργότητα (U/ml) στα ένζυμα GR (P<0,05), SOD (P<0,01), GST (P<0,001), GSH-Ρx (P<0,05) και αυξημένη (P<0,01) συγκέντρωση πρωτεΐνης (σε mg/ml) στο πλάσμα του αίματος, αυξημένη (P<0,001) δραστικότητα του ενζύμου LPO (σε U/ml) στο γάλα, σε σύγκριση με την ομάδα CON. β) καμία επίδραση στην απόδοση και τη χημική σύνθεση του γάλακτος γ) αύξηση της ατελούς βιοϋδρογόνωσης των C18:1 trans και C18:2n6trans και

αύξηση (P<0.001) των LCFA, AI, και του λόγου Κ/Α λιπαρών οξέων στο γάλα Αυτή η συσσώρευση της υδρογόνωσης ενδιάμεσων των C18trans λιπαρών οξέων, συνδέθηκε με μείωση στην απόδοση των C18cis λιπαρών οξέων όπως C18:1cis-9 και C18:2η-6cis καθώς επίσης και με τη μείωση των λιπαρών οξέων που προέρχονται από de novo σύνθεση (<C16: 0). δ) μείωση των CLA (P<0,05), VA (P<0.001), και C18:1trans-10 (P<0.001) και αύξηση (Ρ<0.05) του λόγου C18:1/C18:0 στο γάλα της ομάδας ALG σε σύγκριση με εκείνες της CON. ε) μείωση (Ρ<0.05) των C14:0, C17:0, C20:1, και αύξηση (Ρ< 0,05) των C18: 0, C18:3n-6 και 18:2η-6trans (Ρ>0,05)στο πλάσμα της ομάδας ALG σε σύγκριση την ομάδα CON. Η ίδια τάση παρατηρήθηκε και στις ενδιάμεσες μορφές ακόρεστων C18 στο πλάσμα και το γάλα. στ) βελτίωση της δραστικότητας της πρωτεάσης (Ρ<0,01) και μείωση της δραστικότητας κελλουλάσης (Ρ<0,01) στο υγρό της μεγάλης κοιλίας της ομάδας ALG σε σύγκριση με εκείνα της ομάδας CON. ζ) στατιστικώς σημαντική αύξηση (Ρ<0,05) των Butyrivibrio fibrosolvens, αύξηση των Ruminococcus flavefaciens, Clostridium sticklandii, των Μεθανογενών και των πρωτόζωων και μείωση των Ruminococcus albus σε δείγματα του υγρού της μεγάλης κοιλία της ομάδας ALG σε σύγκριση με εκείνες της ομάδας CON. Από τα αποτελέσματα αυτά της δραστικότητας των αντιοξειδωτικών ενζύμων και του προφίλ των λιπαρών οξέων του γάλακτος, συμπεραίνεται ότι η συμπλήρωση της διατροφής των IX Abstract αιγών με δύο στελέχη της Chlorella οδηγεί σε σημαντική αύξηση των αντιοξειδωτικών δράσεων των ενζύμων στο πλάσμα του αίματος, αλλά η απόδοση της μεταφοράς στο γάλα είναι χαμηλή. Επίσης, η Chlorella και στα δύο πειράματα μείωσε την παραγωγή των ΛΟ που προέρχονται από de novo σύνθεση και αύξησε τα C18:1 trans. Η αύξηση του C18:1 trans θα μπορούσε να παίξει ένα προστατευτικό ρόλο για τα βακτήρια. Στις αίγες γαλακτοπαραγωγής η μείωση αυτών των λιπαρών οξέων είναι πολύ σημαντική και έχει συσχετιστεί θετικά με την ιδιαίτερη γεύση του αίγειου γάλακτος. Επίσης η προσθήκη C. Vulgaris βελτίωσε το μικροβιακό πληθυσμό και την ενζυμική δραστικότητα των ενζύμων (α-αμυλάση, πρωτεάση και λιπάση) και μείωσε τη δραστικότητα της σελουλάσης του υγρού της μεγάλης κοιλίας.

The aim of the present study was to investigate two strains of green algae Chlorella (C. pyrenoidosa and C. vulgaris) as a natural antioxidants source for dairy goats and to study their effects on: blood plasma and milk antioxidant enzymes activities, rumen fermentation characteristics, blood plasma and milk fatty acid profile, rumen enzymes activities and q-PCR for rumen microbial community. The study included two main experiments as follow: The first experiment was carried out with sixteen dairy crossbred Alpine goats allocated into two groups (CON= control and ALG= treated) of eight goats each for 4 weeks. The CON group received a diet without micro algae, whereas in the ALG group, 10g C. pyrenoidosa /kg were incorporated into concentrates. Goat's feeding was based on wheat straw and alfalfa hay as roughage source, and a concentrate mixture according to their requirements. Milk samples were collected weekly for chemical analysis. Blood and milk samples were also taken every two weeks to determine the activities of CAT, LPO, GST, GSH-Px, GR and SOD enzymes and the fatty acid profile. On the last day of the experiment, rumen samples were collected by a stomach tube 3 hrs after morning feeding and frozen at -80 0 C for rumen fatty acids analysis. The results showed that the supplementation of the goat’s diet with C. pyrenoidosa had: a. increased the GR (P<0.05), SOD (P<0.01) activities (in U/ml), and (P<0.01) protein concentration (mg/ml) in blood plasma, and decreased (P<0.01) milk GSH-Px (U/ml) activity, b. no effect on milk yield and milk chemical composition, while there was an increase (P<0.05) in C18:1 trans and a decrease (P>0.05) in SCFA concentrations, c. an increase of accumulation of C18:0 concentration and a decrease in the C18 intermediates, (P<0.05) MUFA concentrations and (P<0.05) C14:1/C14:0 ratio in rumen, and d. decreased (P< 0.05) C18:2n-6 trans, C18:3n-6, C20:1, C21:0, C20:2, and C20:4 concentrations in blood plasma. The second experiment was carried out with sixteen dairy crossbred Alpine goats which were allocated into two groups (CON=control and ALG=treated) of eight goats each for 4 weeks. The CON group received a diet without micro algae whereas in the ALG group, 10g C. vulgaris /kg were incorporated in the concentrates. Goat's nutrition was based on Onobrychis viciifolia hay and alfalfa hay as a roughage source, and a concentrate according to their requirements. Milk samples were collected weekly for chemical analysis. Blood and milk samples were also collected every two weeks to determine the activities of CAT, LPO, GST, GSH-Px, GR and SOD enzymes and fatty acid profile. On the last day of the experiment, rumen liquid was collected by a stomach tube 3 hrs after morning feeding for rumen enzymes analysis and fatty acid profile. Part of the rumen fluid was kept at -80 ºC for q-PCR analysis. The supplementation of goat diets with 10g C. vulgaris/ kg concentrates had also no effect on milk yield and milk chemical composition but it had: a. increased in the GST (P<0.001), GR (P<0.05), GSH-Px (P<0.05), SOD (P<0.01) activities (U/ml), and protein concentration (P<0.01) in blood plasma and increased (P<0.001) LPO activity (U/ml) in milk. b. increased in accumulate an incomplete biohydrogenation of C18:1trans and C18:3n-3 concentrations and result in a strong accumulation of VA and C18:1 trans-10 and C18:2n-6 concentrations in rumen. The linolenic acid (C18:3n-3) in the rumen leads to the formation of VA and CLA, c. increased incomplete biohydrogenation of C18:1 trans and C18:2n-6trans concentrations. This accumulation of hydrogenation intermediate of C18 trans FA’s associated with decreased in the concentrations yield of C18cis FA’s such as C18:1 cis-9 and C18:2n-6cis and also decreased FA originating from synthesized de novo (<C16:0) and increased (P<0.001) LCFA concentration, AI, and S/U ratio in milk, d. decreased milk CLA, VA, and C18:1 trans-10 concentrations (P<0.05, P<0.001, and P<0.001 respectively) and increased (P<0.05) C18:1/C18:0 ratio. e. decreased plasma (P<0.05) C14:0, C17:0, C20:1 concentrations and increased (P< 0.05) C18:0, C18:3n-6 and (P>0.05) 18:2n-6 trans concentrations. The same trend was observed in unsaturated C18 intermediate in plasma and milk, f. improved protease activity (P < 0.01) and reduced cellulase activity (P< 0.01) in rumen samples, and g. significantly increased (P<0.05) in the population of Butyrivibrio fibrosolvens, insgnificantly increased Ruminococcus flavefaciens, Clostridium sticklandii, Methanogens and protozoa and insignificant reduction of Ruminococcus albus to the total population in rumen samples. From those results of the antioxidant enzyme activities and the milk fatty acid profile, it was concluded that the supplementation of goat’s diet with two strains of Chlorella leads to significant increases of the antioxidant enzyme activities in blood plasma but not in milk. Also, the Chlorella in both experiments decreased the yield of FA originating from de novo synthesis and increased the C18:1 trans concentration. The increase in C18:1 trans production could play a protective role for bacteria. In conclusion, in dairy goats the decrease of concentrations these FA is very important and it has been positively related to “goaty” flavor in goat milk. Also, the adition of C. vulgaris improved the microbial population and the rumen enzymes activity (αamylase, protease and lipase) and redused cellulase activity.