Στελέχη του μύκητα C. beticola που ανήκουν σε διαφορετικούς φαινότυπους ανθεκτικότητας στους DMIs difenoconazole, epoxiconazole, flutriafol επιλέχθηκαν με σκοπό τη διερεύνηση του μηχανισμού ανθεκτικότητας σε βιοχημικό και μοριακό επίπεδο. Τα στελέχη ήταν ανθεκτικά σε έναν, δύο ή και στους τρεις DMIs. Αρχικά, έγινε διερεύνηση αν πρόκειται για εξειδικευμένο μηχανισμό ανθεκτικότητας ή όχι. Για το σκοπό αυτό, πραγματοποιήθηκαν πειράματα μυκητοτοξικότητας in vitro σε παρεμποδιστές της ευρύτερης ομάδας των EBIs και σε άλλους που δρουν σε διαφορετικά βιοχημικά μονοπάτια, έτσι ώστε να ελεγχθεί η ύπαρξη σχέσεων διασταυρωτής ανθεκτικότητας μεταξύ των διάφορων παρεμποδιστών.
Παρατηρήθηκε θετική διασταυρωτή ανθεκτικότητα μεταξύ των DMIs που μελετήθηκαν και μεταξύ αυτών και του tolnaftate. Ακόμη, υπήρξαν κάποιοι φαινότυποι με διπλή ή μονή ανθεκτικότητα στους τρεις DMIs που παρουσίασαν θετική συσχέτιση με τα terbinafine, fenhexamid, spiroxamine. Δεν παρουσιάστηκαν σχέσεις διασταυρωτής ανθεκτικότητας με τους παρεμποδιστές που δρουν σε διαφορετικά μονοπάτια με εξαίρεση την περίπτωση του azoxystrobin.
Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε διερεύνηση του μηχανισμού αποτοξικοποίησης με τον συνεργιστή PBO που έδειξε την έλλειψη συνεργισμού μεταξύ DMIs και PBO, γεγονός που ενισχύει τις ενδείξεις για μηχανισμό ανθεκτικότητας που σχετίζεται με την αλλαγή στη θέσης δράσης. Για το σκοπό αυτό, απομονώθηκε το γονίδιο στόχος των DMIs (CYP51) και αλληλουχήθηκε. Βρέθηκε η αντικατάσταση του Ε (γλουταμινικό οξύ) από Κ (λυσίνη) στη θέση 149 ως κοινή μεταλλαγή στα στελέχη που ήταν ανθεκτικά και στους τρεις DMIs που μελετήθηκαν. Στις υπόλοιπες φαινοτυπικές κατηγορίες βρέθηκαν διάφορες μεταλλαγές οι οποίες δεν μπορούν να συσχετίστουν με την παρατηρούμενη ανθεκτικότητα στους DMIs που μελετήθηκαν.
Συμπερασματικά, η αλλαγή στη θέση δράσης δεν εξηγεί όλους τους φαινότυπους ανθεκτικότητας. Εικάζεται ότι ο μηχανισμός που θα μπορούσε να εξηγήσει τους φαινότυπους σε έναν ή δύο από τους DMIs, με βάση τη βιβλιογραφία, πιθανώς να είναι η υπερέκφραση του γονιδίου στόχου αλλά απαιτείται περαιτέρω έρευνα για να εξακριβωθεί ο ισχυρισμός αυτός.
Isolates of Cercospora beticola belonging to different sensitivity phenotypes to the sterol demethylation-inhibiting (DMIs) fungicides difenoconazole, epoxiconazole and flutriafol were tested in terms of the resistance mechanism responsible by both biochemical and molecular assays. The selected isolates were resistant to either one, two or three DMIs. Cross-resistance studies with other inhibitors of the Ergosterol biosynthesis showed positive cross resistance between the three DMIs that were tested and between DMIs and tolnaftate. There were also some cases of positive cross resistance between some of the DMIs and terbinafine, fenhexamid, spiroxamine. Cross resistance studies with other inhibitors showed no correlation between them and the DMIs tested except for azoxystrobin, where a positive correlation was recorded.
The detoxification mechanism was tested using PBO showing an antagonistic action to DMIs. These results suggest that the mechanism is target modification, so we performed sequence analysis of the gene target of the DMIs (CYP51). We found a common mutation (E149K) in isolates that were resistant to all three DMIs tested, while in the other isolates a number of different mutations were found with no correlation to the observed resistance phenotypes.
In conclusion, site modification does not explain all the resistant phenotypes. It is possible that the mechanism that explains these phenotypes is overexpression, something that has already be shown in other studies, but in order to be able to claim something like this more research must be done.
