Biotechnological treatment of olive mill wastewaters-based media: production of added-value compounds with the use of strains of yeasts Yarrowia lipolytica and Saccharomyces cerevisiae

Abstract

The ability of two yeast species, Yarrowia lipolytica [strains ACA-YC 5028, ACA-YC 5033 and W29 (ATCC 20460)] and Saccharomyces cerevisiae (strain MAK-1), to simultaneously bioremediate (reduce phenolic content and color) olive mill wastewater (OMW)-based media and produce (high-) added value products (yeast biomass, citric acid, ethanol, cellular lipids) was assessed at the present study, which is divided in four main parts: In the first part of this work, the ability of three Yarrowia lipolytica strains to grow on and convert glucose-enriched OMWs into microbial mass, cellular lipids and citric acid in aseptic shake-flask cultures was assessed. Decolorization (~63%) and removal of phenolic compounds (~34% w/w) occurred. In nitrogen-limited cultures citric acid in non-negligible quantities was produced [maximum citric acid (Citmax) ~18.1 g L−1; total citric acid yield on glucose consumed (YCit/Glc) ~0.51 g g−1] but adaptation of cultures to media supplemented with OMWs reduced the final citric acid quantity and conversion yield values achieved. In contrast, the accumulation of cellular lipids was favored by OMWs addition compared to the control experiment (no OMWs addition). On the other hand, in carbon-limited cultures, insignificant amounts of citric acid were produced (as excpected) whereas, despite the presence of inhibitory compounds into the medium, biomass production [maximum biomass (Xmax) ~13.0 g L−1; dry cell weight yield on glucose consumed (YX/Glc) ~0.45 g g−1] was enhanced with the addition of OMWs into the synthetic medium, as compared with the control experiment (no OMW addition). Fatty acid analysis of total cellular lipids produced demonstrated that for all strains, cultures in media supplemented with OMWs favored the biosynthesis of cellular lipids that contained increased concentrations of cellular oleic acid. In the second part of this thesis, the ability of a selected Y. lipolytica strain that in the previous part had produced significant quantities of citric acid irrespective of the addition of OMWs into the medium, namely ACA-YC 5033, to grow on glucose-enriched OMWs was further studied. Higher quantities of OMWs as compared with the first part of the work were added, trials were also performed in pasteurized media (besides aseptic cultures), while equally batch bioreactor experiments were performed. Decolorization (~58%) and remarkable removal of phenolic compounds [up to 51% w/w, at the trial with initial phenolic compounds concentration (Ph0) ~5.50 g L-1] occurred. Such high value of phenolic compounds removal from the fermentation medium that occurred in the above-mentioned fermentation, was amongst the highest ones reported so far in the international literature concerning growth of yeasts on phenol-containing residues. In nitrogen-limited flask fermentations (in which Citmax~19.0 g L−1; YCit/Glc~0.74 g g−1), dry cell weight concentration was reduced proportionally to the phenolic content but the addition of OMWs, very interestingly, stimulated proportionally reserve lipid accumulation process [maximum total lipid (Lmax) ~1.0 g L−1; total lipid yield in biomass (YL/X) ~0.27 g g−1] comparing to control experiments, suggesting that OMWs seemed to be a “lipogenic” medium. The overall maximum total citric acid concentration achieved (Citmax~47.0 g L−1; YCit/Glc~0.67 g g−1) occurred in the trial with the highest commercial sugar supplementation of OMW-based media (initial glucose concentration, Glc0, ~80.0 g L−1). On the other hand, cultures performed at high phenol content media (Ph0~4.50 and 5.50 g L−1) clearly inhibited the growth of the microorganism, but surprisingly enough lipid accumulation seemed to be stimulated by the addition of OMWs at these ratios. In carbon-limited fermentations, biomass production was enhanced by OMW addition. In the aspect of a potential scale-up of the technology and in order to reduce the cost of the proposed bioprocess, shake-flask and batch bioreactor experiments were performed in a previously pasteurized medium; comparing aseptic and pasteurized shake-flasks cultures, no significant differences were observed in kinetics (for both biomass and lipid production) while the assimilation rate of glucose (in g L-1 h-1) seemed to be linear for both experiments, with glucose consumption rate being higher in the aseptic than the in pasteurized cultures. On the contrary reduction of citric acid production was observed in the pasteurized trial by both means of Citmax and YCit/Glc values. Comparing aseptic shake-flask and the respective aseptic bioreactor fermentations of OMW-based media (that presented almost equal Glc0 and Ph0 concentrations), biomass and lipid production were insignificantly enhanced in bioreactor trials whereas the strain reached its kinetics plateau earlier in shake-flasks than in bioreactor cultures. Glucose consumption rate was higher in the shake-flask cultures. Concerning citric acid production, it seemed to decrease in the bioreactor cultures (by both means of Citmax and YCit/Glc values). At the third part of the manuscript, the ability of Saccharomyces cerevisiae strain MAK-1 to grow on and convert glucose-enriched OMWs into biomass, cellular lipids and ethanol in aseptic and non-aseptic shake-flask and batch bioreactor cultures was assessed. In general, aseptic and non-aseptic processes demonstrated similar kinetic results. Decolorization (∼63%) and phenol removal (∼34% w/w) from OMWs was achieved. In aseptic shake-flask cultures, enrichment with OMWs increased ethanol and biomass production. Batch-bioreactor trials performed showed higher ethanol [maximum ethanol concentration (EtOHmax) ~52.0 g L-1; ethanol yield on glucose (YEtOH/Glc) ~0.46 g g−1] and lower biomass quantities compared with the respective shake-flask experiments. Moreover, OMWs addition in batch-bioreactor trials significantly enhanced biomass production while it did not remarkably affect ethanol biosynthesis. Fatty acid analysis of cellular lipids demonstrated that in OMW-based media, cellular lipids contained increased concentrations of oleic and linoleic acid in accordance with the repective trials of the first part of this study when Y. lipolytica strains were used. At the fourth part of this thesis, the ability of Saccharomyces cerevisiae strain MAK-1 to grow on and convert blends of OMWs and molasses into biomass and ethanol under non-aseptic shake-flask and batch bioreactor cultures was assessed. OMWs were used as simultaneous substrate and process water of the fermentations employed and molasses were used as low-cost substrate to supplement already existing OMWs sugar content for the enhancement of added value compounds production. The rationale of the utilization of OMW and molasses blends was to study the effect of these mixtures of residues upon the physiological and kinetic behavior of the strain, since in a potential scale-up of the process, OMWs could be used as tap water substitute for molasses dilution. This is the first time in the international literature in which such types of blends are used in a fermentation process. Decolorization (~60%) and removal of phenolic compounds (~28% w/w) occurred. Under aerated conditions in shake-flask cultures, adaptation of cultures to molasses media supplemented with OMWs did not significantly decrease ethanol and biomass production. Under similar aerated bioreactor cultures biomass production (Xmax~5.7 g L-1; yield of dry cell weight per total sugars consumed (YX/TS) ~0.07 g g−1) was reduced whereas ethanol production (EtOHmax~42.0 g L-1; YEtOH/TS~0.49 g g−1) significantly increased as compared with the flask cultures. Comparing aerobic with non-aerated bioreactor experiments, biomass production showed some slight decrease whereas ethanol production slightly increased in the latter case. The yeast strains tested in this study could be regarded as possible candidates for simultaneous OMWs remediation and production of (added-) value compounds, in some cases under completely non-aseptic conditions.

Στην παρούσα μελέτη, η οποία αποτελείται από τέσσερα μέρη, διερευνήθηκε η ικανότητα δύο ειδών ζυμομυκήτων, του Yarrowia lipolytica [στελέχη ACA-YC 5028, ACA-YC 5033 και W29 (ATCC 20460)] και του Saccharomyces cerevisiae (στέλεχος MAK-1) να αυξηθούν σε υποστρώματα με βάση τα υγρά απόβλητα ελαιουργίας (ΥΑΕ) ώστε να παραχθούν πολύτιμοι μεταβολίτες (βιομάζα, αιθανόλη, κιτρικό οξύ και κυτταρικά λιπίδια) χρήσιμοι στη Βιομηχανική Βιοτεχνολογία και την Τεχνολογία Τροφίμων και ταυτοχρόνως να μειωθεί η ρυπογόνος δύναμη του αποβλήτου μέσω της μείωσης της συγκέντρωσης των φαινολικών ενώσεων αλλά και του χρώματός του. Στο πρώτο μέρος, διερευνήθηκε η ικανότητα τριών στελεχών της ζύμης Y. lipolytica να αυξηθούν σε υποστρώματα με βάση τα ΥΑΕ υπό ασηπτικές συνθήκες σε ανακινούμενες φιάλες, ώστε να παραχθεί βιομάζα, κιτρικό οξύ και κυτταρικά λιπίδια υπό συνθήκες περιοριστικές σε άζωτο [αρχική συγκέντρωσης γλυκόζης (Glc0) ~35.0 g L−1, αρχικός λόγος άνθρακα/αζώτου (C/N) ~85] και υπό συνθήκες περιοριστικές σε άνθρακα (Glc0~28.0 g L−1, C/N~13). Έγινε προσθήκη ΥΑΕ στο συνθετικό μέσο σε διάφορες αναλογίες ώστε η αρχική συγκέντρωση φαινολικών ενώσεων (Ph0) να είναι (σε g L−1): 0.00 (πείραμα αναφοράς χωρίς προσθήκη ΥΑΕ στο συνθετικό μέσο), ~1.15 και ~1.55. Σημειώθηκε αποχρωματισμός (εύρος μέγιστων τιμών 45-63%) και μείωση των φαινολικών ενώσεων (εύρος μέγιστων τιμών 13-34% w/w) στο μέσο τόσο στις ζυμώσεις υπό συνθήκες περιοριστικές σε άζωτο όσο και στις ζυμώσεις υπό συνθήκες περιοριστικές σε άνθρακα. Το ποσοστό μείωσης του χρώματος και μείωσης των φαινολικών ενώσεων του μέσου έδειξε να αυξάνεται με την προσθήκη ΥΑΕ (εξαιρώντας το στέλεχος ACA-YC 5033). Στις καλλιέργειες υπό συνθήκες περιοριστικές σε άζωτο παράχθηκε σε ικανοποιητικές ποσότητες συνολικό κιτρικό οξύ [π.χ. μέγιστη συγκέντρωση κιτρικού οξέος (Citmax) ~18.1 g L−1, με αντίστοιχο συντελεστή απόδοσης κιτρικού οξέος προς αναλωθείσα γλυκόζη (YCit/Glc) ~0.51 g g−1.για το στέλεχος Y. lipolytica ACA-YC 5033 σε υποστρώματα εμπλουτισμένα με ΥΑΕ]. Το ισοκιτρικό οξύ παρουσίασε μια ποσότητα της τάξης του 5 – 8% w/w του συνολικού κιτρικού οξέος που παράχθηκε, ανεξαρτήτα από το στέλεχος που χρησιμοποιήθηκε. Η προσθήκη ΥΑΕ οδήγησε σε σοβαρή μείωση της παραγωγής του κιτρικου οξέος (τόσο σε απόλυτες τιμές συγκέντρωσης όσο και σε τιμές του συντελεστή απόδοσης) ειδικά για το στέλεχος W29. Αντίθετα, η παραγωγή των κυτταρικών λιπιδιών ευνοήθηκε με την προσθήκηΥΑΕ συγκρίνοντας με το πείραμα αναφοράς (χωρίς προσθήκη ΥΑΕ) κυρίως για το στέλεχος W29 [μέγιστη συγκέντρωση ολικού λίπους (Lmax) ~1.9 g L−1, λίπος επί ξηρής μάζας (YL/X) ~0.28 g g−1], υποδεικνύοντας πως η προσθήκη ΥΑΕ ευνόησε τη διαδικασία συσσώρευσης λίπους. Αξίζει να σημειωθεί πως στις περισσότερες ζυμώσεις υπό συνθήκες περιοριστικές σε άζωτο, παρουσιάστηκε μερική μείωση της συγκέντρωσης του παραγόμενου λίπους (υπό την έννοια τόσο των τιμών Lmax όσο και των τιμών YL/X) στην αρχή της στατικής φάσης αύξησης του μικροοργανισμού, ακριβώς πριν ξεκινήσει σε αυξημένες συγκεντρώσεις η έκκριση κιτρικού οξέος στο μέσο. Στις ζυμώσεις υπό συνθήκες περιοριστικές σε άνθρακα δεν παράχθηκε κιτρικό οξύ (όπως άλλωστε αναμενόταν) και παρά την ύπαρξη παρεμποδιστικών παραγόντων (π.χ. φαινολικών συστατικών), η παραγωγή της βιομάζας [μέγιστη συγκέντρωση βιομάζας (Xmax) ~13.0 g L−1, συντελεστής απόδοσης βιομάζας (YX/Glc) ∼0.45 g g−1] ενισχύθηκε με την προσθήκη ΥΑΕ στο συνθετικό μέσο. Υπήρξε σημαντικά υψηλότερη παραγωγή βιομάζας στις ζυμώσεις υπό συνθήκες περιοριστικές σε άνθρακα από ότι στις ζυμώσεις υπό συνθήκες περιοριστικές σε άζωτο όπως επίσης και ο ρυθμός κατανάλωσης της γλυκόζης ήταν μεγαλύτερος στις ζυμώσεις υπό συνθήκες περιοριστικές σε άνθρακα. Αναφορικά με την παραγωγή ολικού λίπους, στις περισσότερες ζυμώσεις υπό συνθήκες περιοριστικές σε άνθρακα το λίπος επί ξηρής μάζας μετρήθηκε στο εύρος 5-12% w/w επί ξηρής ουσίας, υποδεικνύοντας πως δεν υπήρξε αξιοσημείωτη συσσώρευση κυτταρικων λιπιδίων υπό αυτές τις συνθήκες. Η ανάλυση των λιπαρών οξέων των κυτταρικών λιπιδίων που παράχθηκαν, έδειξε ότι η προσαρμογή όλων των στελεχών της ζύμης στα υποστρώματα με βάση τα ΥΑΕ έστρεψε το μεταβολισμό προς τη σύνθεση κυτταρικών λιπιδίων που περιείχαν αυξημένες συγκεντρώσεις κυτταρικού ελαϊκού οξέος. Δεδομένης της δυναμικής του στελέχους ACA-YC 5033 να παράγει σε υψηλές ποσότητες κιτρικό οξύ ανεξάρτητα από την προσθήκη ΥΑΕ στο συνθετικό μέσο, στο δεύτερο μέρος της διατριβής, μελετήθηκε η ικανότητα του στελέχους αυτού να αυξηθεί σε υποστρώματα με βάση τα ΥΑΕ (επιπλέον σε ανακινούμενες φιάλες υπό συνθήκες παστερίωσης και σε βιοαντιδραστήρα υπό συνθήκες ασηπτικές αλλά και υπό συνθήκες παστερίωσης) σε υψηλές αρχικές συγκεντρώσεις ΥΑΕ (και συνεπώς φαινολικών συστατικών) στο μέσο της καλλιέργειας. Σημειώθηκε αποχρωματισμός (~58%) και αξιοσημείωτη μείωση των φαινολικών ενώσεων [~51% w/w, τιμή που σημειώθηκε ανέλπιστα στο πείραμα με αρχική συγκέντρωση φαινολικών ενώσεων (Ph0) ~5.50 g L−1]. Η τόσο υψηλή τιμή μείωσης των φαινολικών ενώσεων του μέσου ζύμωσης που σημειώθηκε, ανήκει στις υψηλότερες τιμές που έχουν αναφερθεί ως τώρα στη διεθνή βιβλιογραφία αναφορικά με την αύξηση ζυμών σε υπολείμματα που περιέχουν φαινολικές ενώσεις. Στις καλλιέργειες υπό συνθήκες περιοριστικές σε άζωτο (στις οποίες Citmax~19.0 g L−1, YCit/Glc~0.74 g g−1), η συγκέντρωση της Xmax μειώθηκε αναλογικά με την περιεκτικότητα σε φαινόλες, με την προσθήκη ΥΑΕ στο μέσο. Αξιοσημείωτο είναι πως η προσθήκη ΥΑΕ ενεργοποίησε τη διαδικασία συσσώρευσης λιπιδίων (Lmax~1.0 g L−1, YL/X~0.27 g g−1) εν συγκρίσει με το πείραμα αναφοράς, υποδεικνύοντας πως τα ΥΑΕ δείχνουν να αποτελούν ένα «ελαιοσυσσωρευτικό» υπόστρωμα. Η υψηλότερη συγκέντρωση κιτρικού οξέος που σημειώθηκε σε όλη τη μελέτη (Citmax~47.0 g L−1, YCit/Glc~0.67 g g−1), προέκυψε στη ζύμωση με την υψηλότερη προσθήκη εμπορικής γλυκόζης (Glc0~80.0 g L−1). Στα πειράματα με την υψηλότερη συγκέντρωση φαινολικών ενώσεων (Ph0~4.50 and ~5.50 g L−1) παρουσιάστηκε σημαντική αναστολή της αύξησης του μικροοργανισμού αλλά η παραγωγή των κυτταρικών λιπιδίων ενεργοποιήθηκε με την προσθήκη ΥΑΕ σε αυτές τις αναλογίες. Σε συνθήκες περιοριστικές σε άνθρακα, η παραγωγή βιομάζας ενισχύθηκε από την προσθήκη ΥΑΕ. Συγκρίνοντας τις καλλιέργειες σε ανακινούμενες φιάλες υπό ασηπτικές συνθήκες και συνθήκες παστερίωσης σημειώθηκαν μη αξιοσημείωτες αλλαγές όσον αφορά στην κινητική του μικροοργανισμού (τόσο στην παραγωγή βιομάζας οσο και στην παραγωγή ολικού λίπους) ενώ ο ρυθμός κατανάλωσης της γλυκόζης ήταν γραμμικός και στις δύο περιπτώσεις με υψηλότερο αυτόν στις ζυμώσεις υπό ασηπτικές συνθήκες από ότι στις ζυμώσεις υπό συνθήκες παστερίωσης. Αντίθετα, παρατηρήθηκε μείωση της παραγωγής κιτρικού οξέος στις ζυμώσεις υπό συνθήκες παστερίωσης υπό την έννοια τόσο των απόλυτων τιμών Citmax όσο και των σχετικών τιμών YCit/Glc. Συγκρίνοντας τα πειράματα σε ανακινούμενες φιάλες υπό ασηπτικές συνθήκες με τα αντίστοιχα πειράματα σε βιοαντιδραστήρα (που παρουσίασαν παρόμοιες συγκεντρώσεις Glc0 και Ph0), παρατηρήθηκε μη-αξιοσημείωτη βελτίωση στην παραγωγή βιομάζας και λιπιδιών ενώ το στέλεχος παρουσίασε νωρίτερα τη στατική του φάση στις φιάλες από ότι στο βιοαντιδραστήρα. Ο ρυθμός κατανάλωσης της γλυκόζης ήταν υψηλότερος στις ζυμώσεις σε φιάλες. Η παραγωγή κιτρικού οξέος μειώθηκε στις ζυμώσεις σε βιοαντιδραστήρα (υπό την έννοια τόσο των τιμών Citmax όσο και των τιμών YCit/Glc). Στο τρίτο μέρος, διερευνήθηκε η ικανότητα της ζύμης S. cerevisiae στέλεχος MAK-1 να αυξηθεί σε υποστρώματα με βάση τα ΥΑΕ ώστε να παραχθεί βιομάζα, αιθανόλη και κυτταρικά λιπίδια σε ανακινούμενες φιάλες και σε βιοαντιδραστήρα υπό ασηπτικές αλλά και μη ασηπτικές συνθήκες (σε όλες τις περιπτώσεις η σύγκριση ασηπτικών και μη ασηπτικών συνθηκών παρουσίασε παρόμοια κινητική). Στις ζυμώσεις σε ανακινούμενες φιάλες υπό ασηπτικές αλλά και μη ασηπτικές συνθήκες, έγινε προσθήκη ΥΑΕ στο συνθετικό μέσο σε διάφορες αναλογίες ώστε η Ph0 να είναι (σε g L−1): 0.00 (πείραμα αναφοράς χωρίς προσθήκη ΥΑΕ στο συνθετικό μέσο), ~1.20, ~2.00 και~2.90. Για κάθε Ph0 προστέθηκε στο μέσο ποσότητα γλυκόζης ώστε η αρχική συγκέντρωσή αυτής να είναι (σε g L−1): ~40.0, ~55.0 και ~75.0 . Τόσο η μέγιστη συγκέντρωση αρχικής γλυκόζης που επιλέχθηκε, όσο και οι αρχικές συγκεντρώσεις φαινολικών ενώσεων, αναφέρονται στις αντίστοιχες συγκεντρώσεις που μπορεί να βρεθούν σε τυπικά ΥΑΕ παραγόμενα από διάφορες μεθόδους πίεσης του ελαιοκάρπου. Στις καλλιέργειες με ανακινούμενες φιάλες υπό ασηπτικές συνθήκες, η προσθήκη ΥΑΕ αύξησε θεαματικά την παραγωγή βιομάζας παρά το γεγονός ότι, όπως αναφέρθηκε, τα ΥΑΕ περιέχουν ανασταλτικούς παράγοντες. Η υψηλότερη τιμή Χmax που σημειώθηκε ήταν ~19.0 g L−1 στο πείραμα με Glc0~75.0 g L−1 και Ph0~2.90 g L−1 (ενώ Χmax~11.0 g L−1 σημειώθηκε στο αντίστοιχο πείραμα αναφοράς). Επίσης, όπως αναμενόταν, με την αύξηση της αρχικής συγκέντρωσης γλυκόζης στο μέσο, παρατηρήθηκε και αύξηση της παραγωγής της βιομάζας. Σημαντικό σημείο αποτελεί το γεγονός ότι μετά την ολική κατανάλωση της γλυκόζης του μέσου, η αιθανόλη που είχε παραχθεί άρχισε να καταναλώνεται προς νέα παραγωγή βιομάζας και σε αρκετές περιπτώσεις δε, παρατηρούταν η ανακατανάλωση όλης της ποσότητας της προηγούμενης συντιθέμενης αιθανόλης. Η μέγιστη συγκέντρωση αιθανόλης (EtOHmax) που παράχθηκε στις ζυμώσεις σε ανακινούμενες φιάλες ήταν ~26.0 g L−1 με συντελεστή απόδοσης αιθανόλης (YEtOH/Glc) ~0.36 g g−1 στο πείραμα με Glc0~75.0 g L−1 και Ph0~2.90 g L−1 ενώ ο υψηλότερος συντελεστής απόδοσης αιθανόλης ήταν ~0.47 g g−1 (με αντίστοιχη μέγιστη συγκέντρωση αιθανόλης ~17.0 g L−1) στο πείραμα με Glc0~40.0 g L−1 και Ph0~2.00 g L−1. Η προσθήκη ΥΑΕ στο συνθετικό μέσο έως μία συγκεκριμένη αναλογία ευνόησε την παραγωγή της αιθανόλης. Λαμβάνοντας υπ’όψιν το συντελεστή απόδοσης αιθανόλης, σημειώνεται πως σημαντικά υψηλότερη τιμή αυτού παρατηρήθηκε στη ζύμωση με Ph0~2.0 g L−1, συνθήκες οι οποίες επιλέχθηκαν για προσαρμογή της πειραματικής διαδικασίας σε ζυμώσεις σε βιοαντιδραστήρα. Συγκρίνοντας τις ζυμώσεις σε φιάλες υπό ασηπτικές συνθήκες (Glc0~40.0 g L−1, Ph0~0.00 g L−1 και Glc0~75.0 g L−1, Ph0~2.90 g L−1) με τις αντίστοιχες υπό μη ασηπτικές συνθήκες, σημειώνεται πως δεν παρατηρήθηκε διαφορά τόσο στην παραγωγή βιομάζας όσο και στην παραγωγή αιθανόλης. Αναφορικά με τις ζυμώσεις που πραγματοποιήθηκαν σε βιοαντιδραστήρα έγινε σύγκριση πειράματος αναφοράς (ζύμωση χωρίς προσθήκη ΥΑΕ) υπό ασηπτικές και υπό μη ασηπτικές συνθήκες χωρίς να παρατηρηθεί αξιοσημείωτη διαφορά στην κινητική του μικροοργανισμού. Ακολούθως, μελετήθηκε η επίδραση του αερισμού (0.0, 0.5, 1.0 και 1.5 vvm) της καλλιέργειας και δεν παρατηρήθηκε αξιοσημείωτη διαφορά στην κινητική. Λόγω των παραπάνω παρατηρήσεων επιλέχθηκαν (για λόγους μείωσης κόστους) οι μη-ασηπτικές συνθήκες χωρίς αερισμό για τη συνέχεια των πειραμάτων με την προσθήκη στο μέσο ΥΑΕ, γεγονός το οποίο οδήγησε σε αξιοσημείωτη αύξηση της βιομάζας χωρίς όμως να επηρεάσει τη βιοσύνθεση της αιθανόλης. Σημειώνεται επίσης πως, οι ζυμώσεις που πραγματοποιήθηκαν σε βιοαντιδραστήρα παρουσίασαν υψηλότερες ποσότητες αιθανόλης και χαμηλότερες βιομάζας εν συγκρίσει με τα αντίστοιχα πειράματα των ανακινούμενων φιαλών. Τέλος, προκειμένου να αυξηθεί η συγκέντρωση της παραγόμενης αιθανόλης πραγματοποιήθηκε ζύμωση σε βιοαντιδραστήρα υπό μη ασηπτικές συνθήκες χωρίς αερισμό με αρχική συγκέντρωση γλυκόζης ~115.0 g L-1 και αρχική συγκέντρωση φαινολικών ενώσεων ~2.90 g L-1 με EtOHmax~52.0 g L-1 (YEtOH/Glc~0.46 g g−1). Σημειώθηκε αξιοσημείωτος αποχρωματισμός (~63%) και μείωση των φαινολικών ενώσεων (~34% w/w) στο μέσο. Για μια δεδομένη αρχική συγκέντρωση γλυκόζης, αναφορικά με τις ζυμώσεις σε ανακινούμενες φιάλες, το ποσοστό μείωσης του χρώματος και μείωσης των φαινολικών ενώσεων του μέσου αυξήθηκε με την προσθήκη ΥΑΕ. Συγκρίνοντας τις τιμές αποχρωματισμού και μείωσης φαινολικών ενώσεων στα πειράματα σε φιάλες υπό μη ασηπτικές συνθήκες με αυτές των αντίστοιχων ζυμώσεων σε βιοαντιδραστήρα υπό μη ασηπτικές συνθήκες, συμπεραίνεται ότι ήταν παρόμοιες. Η ανάλυση των λιπαρών οξέων των κυτταρικών λιπιδίων (παράχθηκαν σε ποσότητα μικρότερη του 10% w/w επί ξηρής ουσίας), έδειξε ότι στα υποστρώματα με βάση τα ΥΑΕ τα κυτταρικά λιπίδια περιείχαν αυξημένες συγκεντρώσεις ελαϊκού και λινελαϊκού οξέος, κάτι που βρίσκεται σε συμφωνία με τα αντίστοιχα πειράματα του πρώτου μέρους αυτής της μελέτης όπου μελετήθηκαν τα κυτταρικά λιπίδια του μικροοργανισμού Y. lipolytica. Στο τέταρτο μέρος, ερευνήθηκε η ικανότητα της ζύμης S. cerevisiae στέλεχος MAK-1 να αυξηθεί σε μίγματα ΥΑΕ και μελάσας, ώστε να παραχθεί βιομάζα και αιθανόλη σε ανακινούμενες φιάλες και βιοαντιδραστήρα υπό αερόβιες και αναερόβιες, μη ασηπτικές συνθήκες. Τα ΥΑΕ χρησιμοποιήθηκαν ταυτοχρόνως τόσο ως υπόστρωμα της ζύμωσης όσο και ως νερό της διεργασίας και η μελάσα ως χαμηλού κόστους υπόστρωμα για τον εμπλουτισμό των ήδη υπαρχόντων σακχάρων των ΥΑΕ προς την ενίσχυση της παραγωγής προϊόντων προστιθέμενης αξίας. Η λογική της χρήσης μιγμάτων ΥΑΕ και μελάσας ήταν η μελέτη της επίδρασης των μιγμάτων αυτών στη φυσιολογία και την συμπεριφορά της κινητικής του στελέχους, καθώς σε ενδεχόμενη κλιμάκωση μεγέθους των ζυμώσεων, τα ΥΑΕ θα μπορούσαν να αντικαταστήσουν το νερό που χρησιμοποιείται για την αραίωση της μελάσας στη διαδικασία βιοτεχνολογικής επεξεργασίας και αξιοποίησής της. Πραγματοποιήθηκαν προκαταρτικά πειράματα σε υποστρώματα μελάσας αραιωμένα με νερό [αρχική συγκέντρωση ολικών σακχάρων (TS0) ~100.0 g L-1, χωρίς την προσθήκη ΥΑΕ] υπό αερόβιες ασηπτικές συνθήκες σε ανακινούμενες φιάλες για να αξιολογηθεί η προσθήκη διαλύματος μεταλλικών αλάτων (η σύσταση της μελάσας περιλαμβάνει μη αμελητέα ποσότητα μεταλλικών στοιχείων). Η προσθήκη μεταλλικών αλάτων στο μέσο επηρέασε αρνητικά την παραγωγή της βιομάζας και της αιθανόλης, επομένως η πρακτική αυτή εξαιρέθηκε από τη συνέχεια των πειραμάτων. Κατόπιν, ζυμώσεις με μίγματα μελάσας και ΥΑΕ (προσθήκη 10% v/v) σε ανακινούμενες φιάλες υπό ασηπτικές συνθήκες συγκρίθηκαν με αντίστοιχες καλλιέργειες υπό μη ασηπτικές συνθήκες. Η συγκέντρωση της παραγόμενης αιθανόλης ήταν ελαφρώς υψηλότερη και η συγκέντρωση της βιομάζας χαμηλότερη στις ζυμώσεις υπό ασηπτικές συνθήκες. Τα προαναφερθέντα πειράματα υπό μη ασηπτικές συνθήκες θεωρήθηκαν ικανοποιητικά γεγονός το οποίο οδήγησε στην εφαρμογή μη ασηπτικών συνθηκών στις υπόλοιπες ζυμώσεις. Στη συνέχεια εκτελέστηκαν πειράματα σε ανακινούμενες φιάλες υπό μη ασηπτικές συνθήκες με μίγματα μελάσας και ΥΑΕ. Η αρχική συγκέντρωση ολικών σακχάρων ήταν ~100.0 g L-1 και η προσθήκη των ΥΑΕ έγινε στις εξής αναλογίες (% v/v): 0, 10, 20, 30, 40, 50. Η παραγωγή της βιομάζας δεν επηρεάστηκε σοβαρά από την προσθήκη ΥΑΕ στο μέσο, αλλά οι μέγιστες τιμές Xmax και του συντελεστή απόδοσης της παραγόμενης βιομάζας προς αναλωθέντα συνολικά σάκχαρα YX/TS παράχθηκαν στην καλλιέργεια χωρίς προσθήκη ΥΑΕ. Η ποσότητα των ολικών σακχάρων που έμεινε ακατανάλωτη αυξήθηκε με την προσθήκη ΥΑΕ. Αναφορικά με τη βιοσύνθεση της αιθανόλης, η προσθήκη ΥΑΕ στο μίγμα επηρέασε αρνητικά την παραγωγή της εν συγκρίσει με το πείραμα χωρίς την προσθήκη ΥΑΕ (μόνο μελάσα). Η προσθήκη ΥΑΕ σε αναλογία 20% v/v έδωσε ικανοποιητικά αποτελέσματα – αναφορικά με τη βιοσύνθεση τόσο βιομάζας όσο και αιθανόλης – οπότε και επιλέχθηκε ως συνθήκη για εφαρμογή σε ζυμώσεις σε βιοαντιδραστήρες υπό μη ασηπτικές συνθήκες. Αρχικά μελετήθηκε η επιρρόη του αερισμού (0.0 και 1.2 vvm) της καλλιέργειας. Παρατηρήθηκε μη αξιοσημείωτη ελάττωση στην παραγωγή της βιομάζας αλλά και αύξηση στη βιοσύνθεση της αιθανόλης στις καλλιέργειες υπό μη αερισμό. Συγκρινόμενες και οι δύο προαναφερθείσες συνθήκες με το αντίστοιχο πείραμα στις ανακινούμενες φιάλες, σημειώνεται πως η παραγωγή της βιομάζας μειώθηκε εμφανώς και η παραγωγή της αιθανόλης αυξήθηκε στις ζυμώσεις που πραγματοποιήθηκαν στο βιοαντιδραστήρα. Επίσης στις καλλιέργειες που πραγματοποιήθηκαν στις φιάλες, μετά την κατανάλωση όλης της ποσότητας των ολικών σακχάρων του μέσου, η αιθανόλη που είχε παραχθεί άρχισε να καταναλώνεται προς νέα παραγωγή βιομάζας. Λαμβάνοντας υπ’ όψιν πως στις καλλιέργειες που πραγματοποιήθηκαν στο βιοαντιδραστήρα υπό αναερόβιες, μη ασηπτικές συνθήκες παράχθηκε ελαφρώς υψηλότερη ποσοτητα αιθανόλης, η σειρά πειραμάτων που ακολούθησε πραγματοποιήθηκε χωρίς αερισμό. Επομένως μελετήθηκαν ζυμώσεις στο βιοαντιδραστήρα υπό μη ασηπτικές συνθήκες χωρίς αερισμό με προσθήκη ΥΑΕ σε σταθερή αναλογία (20% v/v) και αυξανόμενη συγκέντρωση ολικών σακχάρων (μέσω της προσθήκης αυξανόμενης ποσότητας μελάσας) σε (g L-1): ~100.0, ~135.0, ~150.0, ~200.0. Η αύξηση της ποσότητας της μελάσας επηρέασε αρνητικά την αύξηση του μικροοργανισμού και την αφομοίωση των σακχάρων με αποτέλεσμα στο πείραμα με TS0~200.0 g L-1 να μην παρατηρηθεί καθόλου αύξηση του μικροοργανισμού. Αναφορικά με τη βιοσύνθεση της αιθανόλης, η προσθήκη μελάσας στο μέσο ευνόησε την παραγωγή της αναλογικά έως την καλλιέργεια με TS0~135.0 g L-1. Πέραν αυτής της συγκέντρωσης η παραγωγή της αιθανόλης επηρεάστηκε αρνητικά (π.χ. καθόλου αιθανόλη δεν παράχθηκε στο πείραμα με TS0~200.0 g L-1). Σημειώθηκε αποχρωματισμός (εύρος μέγιστων τιμών 28-60%) και μείωση των φαινολικών ενώσεων (εύρος μέγιστων τιμών 12-26% w/w). Συγκρίνοντας τις τιμές των ποσοστών αποχρωματισμού και μείωσης φαινολικών ενώσεων στα πειράματα σε φιάλες υπό μη ασηπτικές συνθήκες με αυτές των αντίστοιχων ζυμώσεων σε βιοαντιδραστήρα υπό μη ασηπτικές συνθήκες, συμπεραίνεται ότι ήταν παρόμοιες. Τα στελέχη των ζυμομυκήτων που μελετήθηκαν, μπορούν να θεωρηθούν ως υποψήφιοι μικροοργανισμοί για την ταυτόχρονη απορρύπανση των ΥΑΕ και την παραγωγή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας χρήσιμων στη βιομηχανία των τροφίμων, σε ορισμένες περιπτώσεις υπό μη ασηπτικές συνθήκες.