Μοριακή και βιοχημική διερεύνηση της ανθεκτικότητας του μύκητα Fusarium graminearum στα βενζιμιδαζολικά μυκητοκτόνα

Abstract

Στη παρούσα εργασία, μετρίου και υψηλού επιπέδου ανθεκτικά στα βενζιμιδαζολικά στελέχη του μυκοτοτοξικογόνου και φυτοπαθογόνου μύκητα Fusarium graminearum Schwabe που είχαν σε προηγούμενη μελέτη αποκτηθεί μέσω μεταλλαξιγέννεσης και κατόπιν χαρακτηρισθεί φυτοπαθολογικά (Sevastos και συνεργάτες, 2013), διερευνήθηκαν ως προς τον υπεύθυνο μηχανισμό ανθεκτικότητας των στελεχών αυτών στα βενζιμιδαζολικά. Πειράματα εκτίμησης της έκφρασης ανθεκτικότητας in vivo έδειξαν ότι τα ανθεκτικά στελέχη εξέφραζαν την ανθεκτικότητα τους σε σπάδικες καλαμποκιού που είχαν προηγουμένως εμβαπτιστεί σε τοξικές συγκεντρώσεις carbendazim (MBC) πράγμα το οποίο σημαίνει ότι ο κίνδυνος για εμφάνιση και επικράτηση τέτοιων ανθεκτικών στελεχών στον αγρό είναι εφικτός. Μοριακές μελέτες αλληλούχισης του γονιδίου που κωδικοποιεί το βιοχημικό στόχο των βενζιμιδαζολικών και με τη χρήση της τεχνικής Allele Specific Polymerase Chain Reaction, απεκάλυψαν την ύπαρξη δύο διαφορετικών μεταλλαγών στο γονίδιο της β2-τουμπουλίνης των μετρίου επιπέδου ανθεκτικότητας στελεχών. Η πρώτη μεταλλαγή που ανιχνεύτηκε ήταν η H6N, όπου υπήρξε αντικατάσταση της ιστιδίνης στη θέση 6 με ασπαραγίνη. Η δεύτερη μεταλλαγή αφορούσε την F200Y, όπου υπήρξε αντικατάσταση της φαινυλανίνης στη θέση 200 με τυροσίνη. Καμία μεταλλαγή δεν ανιχνεύτηκε στα υψηλής ανθεκτικότητας στελέχη. Αλληλούχιση του ομόλογου γονιδίου της β1-τουμπουλίνης έδειξε ότι η ανθεκτικότητα των στελεχών δεν φαίνεται να οφείλεται σε σημειακές μεταλλαγές του γονιδίου αυτού. Μελέτες εκτίμησης των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων της β1 και β2 τουμπουλίνης μέσω της τεχνικής Real Time-Polymerase Chain Reaction, απεκάλυψαν ότι αμφότερες οι δύο β-τουμπουλίνες των ανθεκτικών στελεχών εκφράζονταν σε υψηλότερα επίπεδα από ότι στο άγριο στέλεχος, όταν η καλλιέργεια των στελεχών γινόταν σε υλικό απουσία MBC. Αντιθέτως, παρουσία MBC φάνηκε να οδηγεί σε μείωση των επιπέδων έκφρασης των β-τουμπουλίνων στα περισσότερα από τα ανθεκτικά στελέχη σε σχέση με τα επίπεδα που μάρτυρα. Παρ’ όλα αυτά δεν φαίνεται να υπάρχει κάποια συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης των δύο γονιδίων και των παρατηρούμενων ανθεκτικών φαινοτύπων Ακολούθησε διερεύνηση άλλων βιοχημικών μηχανισμών ανθεκτικότητας όπως η αποτοξικοποίηση και η μειωμένη είσοδος-αυξημένη απέκκριση. Όσο αναφορά της μελέτες αποτοξικοποίησης αρχικά αξιολογήθηκε η επίδραση των συνεργιστών s,s,s-tributyl phosphorotrithioate, piperonyl butoxide και diethyl malate στην μυκητοτοξικότητα των βενζιμιδαζολικών και φάνηκε ότι μόνο στη περίπτωση του συνεργιστή diethyl malate υπήρξε σημαντική μυκητοτοξική δράση στα περισσότερα ανθεκτικά στελέχη με τα βενζιμιδαζολικά μυκητοκτόνα. Στη συνέχεια η μελέτη της αποτοξικοποίησης προσεγγίστηκε πιο ειδικά μέσω ενζυμικών αναλύσεων της τρανσφεράσης της γλουταθειόνης (GST) και της υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης (GSPO) από εκχυλίσματα κυττάρων των στελεχών που είχαν αναπτυχθεί προηγουμένως σε διάφορες συγκεντρώσεις του MBC. Παρατηρήθηκε ότι όλα τα στελέχη παρουσίαζαν υψηλή δραστικότητα του ενζύμου της GST σε σχέση με το μάρτυρα αν και δεν φάνηκαν να υπάρχουν σημαντικές διαφορές που να δικαιολογούν τον μηχανισμό της ανθεκτικότητας στα υψηλής ανθεκτικότητας στελέχη. Ενζυμικές αναλύσεις της GSPO, δεν έδειξαν ότι η δραστικότητα του ενζύμου αυτού ευθύνεται για τον μηχανισμό ανθεκτικότητας σε κανένα από τα ανθεκτικά στελέχη. Αξιολόγηση του μηχανισμού της κινητικής εισόδου-απέκκρισης των βενζιμιδαζολικών μέσω της χρήσης της UV- φασματοφωτομετρίας έδειξε πως η συγκέντρωση του MBC στο υλικό ανάπτυξης των υψηλής ανθεκτικότητας στελεχών μειούταν σημαντικά σε σύγκριση με το ευαίσθητο στέλεχος, οδηγώντας έτσι στο συμπέρασμα ότι υπεύθυνος μηχανισμός ανθεκτικότητας των στελεχών αυτών δεν μπορεί να είναι η αυξημένη απέκκριση. Από τα αποτελέσματα των μελετών αυτών, προκύπτει πως η ανθεκτικότητα στα μετρίας ανθεκτικότητας στελέχη του μύκητα F. graminearum οφείλεται κατά κύριο λόγο στην ύπαρξη μεταλλαγών στο γονίδιο της β2-τουμπουλίνης ενώ στα υπόλοιπα της υψηλής ανθεκτικότητας στελέχη ο μηχανισμός της ανθεκτικότητας παραμένει άγνωστος και δεν φαίνεται να οφείλεται σε αλλαγή στη θέση δράσης, σε υπερέκφραση του βιοχημικού στόχου, σε αποτοξικοποίηση και σε αυξημένη απέκκριση.

Highly (HR) and moderately (MR) carbendazim-resistant strains of the mycotoxigenic and phytopathogenic fungus Fusarium graminearum Schwabe which were previously obtained by mutagenesis and characterized about their fitness parameters (Sevastos et al., 2013) were investigated in this study for their resistance mechanism in benzimidazole fungicides. Studies on the expression of carbendazim resistance in vivo revealed that the most mutants expressed their resistance on corn cobs treated with lethal concentrations of MBC, indicating that the risk of resistance appearance of such mutants in field is possible. Sequencing analysis of the gene encoding the target site of benzimidazoles coupled with Allele Specific Polymerase Chain Reaction, revealed two point mutations at codons 6 (A6N) and 200 (F200Y) in the β2-tubulin gene present in isolates from the MR phenotype. No point mutations were indentified in HR strains which had identical deduced amino acid sequences of the β1 and β2- tubulins with those of the wild-type strain. Real-time PCR assays from strains grown in absence of carbendazim showed that the relative expression levels of β- tubulins were significantly higher than those in the wild-type strain. On the other hand, when treated with MBC, the expression levels of β- tubulins in most of mutant strains were decreased as compared with their control. These data indicate that the expression levels of the two β-tubulins are not correlated with carbendazim resistance phenotypes. Further studies were concerned with other biochemical resistance mechanisms including detoxification and decreased permeability- increased efflux. Detoxification studies implemented with the synergists s,s,s-tributyl phosphorotrithioate, piperonyl butoxide and diethyl malate revealed that the synergist diethyl malate caused significant enhancement of the efficacy of benzimidazoles against the most of resistant strains. Enzyme assays of glutathione transferase (GST) and glutathione hyperoxidase (GSPO) from cell-free extracts showed that all resistant strains displayed high levels of GST enzymatic activity as compared with the control. However, no significant differences in enzymatic activities in GST and GSPO were observed with any of the resistant strains. Kinetic studies on the uptake-efflux mechanism of benzimidazoles by UV- spectrophotometric analysis indicated that the concentration of carbendazim in liquid culture of HR strains was decreased rapidly and to a higher extend as compared to the wild-type, suggesting that increased efflux could not associated with the resistance mechanism in these two mutants. Finally, these data, shows that benzimidazole resistance in MR mutants of F. graminearum is correlated with point mutations in the β2- tubulin gene while the resistance mechanism in the remaining HR strains remains unknown and it seems to be other than target- site modification, overexpression of target-site, detoxification and incr eased efflux.