Χαρακτηρισμός και δυναμική έκφραση του γονιδίου CYP450 της οικογένειας 71Α από την ελιά

Abstract

Στη παρούσα διατριβή ολοκληρώθηκε η απομόνωση του γονιδίου της ελιάς P450 που κατατάσσεται στα φυτικά κυτοχρώματα, με την ενίσχυση του 3’ άκρου της ακολουθίας με την μέθοδο 3’ RACE-PCR. Το γονίδιο της ελιάς που απομονώθηκε αποτελείται από 1647 βάσεις και φέρει ανοιχτό αναγνωστικό πλαίσιο 1524 βάσεων και 507 αμινοξέων. Εισάγοντας την ακολουθία του γονιδίου στο πρόγραμμα blastx για την μετάφραση νουκλεοτιδικών ακολουθιών και την εύρεση των ομόλογων σε πρωτεϊνικό επίπεδο, δείχθηκε πως το γονίδιο συγκαταλέγεται στην οικογένεια 71 και υποοικογένεια Α των φυτικών Ρ450, μέλη της οποίας εμπλέκονται κυρίως στη βιοσύνθεση μονοτερπενίων σε διάφορα φυτικά είδη. Με στόχο την παραγωγή και την απομόνωση της πρωτεΐνης CYP71A- Olea πραγματοποιήθηκε η έκφραση της σε βακτήρια Escherichia coli. Χρησιμοποιήθηκαν δύο συστήματα ετερόλογης έκφρασης, των φορέων έκφρασης pET και pQE. Η ηλεκτροφόρηση σε SDS-PAGE σε πηκτή πολυακρυλαμίδης έδειξε πως η επιθυμητή πρωτεΐνη παράγεται από τα βακτηριακά κύτταρα αλλά δεν είναι υδατοδιαλυτή, εμφανίζοντας την ζώνη που αντιστοιχεί στο αναμενόμενο μοριακό βάρος της πρωτεΐνης στο ίζημα των δειγμάτων. Πραγματοποιήθηκαν διάφορες συνθήκες ανάπτυξης των βακτηριακών κυττάρων με σκοπό την απόσπαση της πρωτεΐνης από το ίζημα, αλλά σύμφωνα με τις εικόνες ηλεκτροφόρησης των δειγμάτων καμία δεν αποδείχθηκε κατάλληλη για την μεταφορά της πρωτεΐνης στο υπερκείμενο. Για να διαπιστωθεί ότι η αναμενόμενη ζώνη που παρατηρείται μόνο στο ίζημα των δειγμάτων που ηλεκτροφορούνται αντιστοιχεί στην επιθυμητή πρωτεΐνη η οποία παράγεται από τα βακτηριακά κύτταρα, ακολούθησε ανοσοαποτύπωση κατά western. Η μεταφορά των πρωτεϊνών σε μεμβράνη PVDF έγινε με επιτυχία, όμως σήμα δεν ανιχνεύθηκε σε κανένα από τα δείγματα, με αποτέλεσμα να μην καθίσταται εφικτή η διεξαγωγή ασφαλών συμπερασμάτων.

Isolation of the full-length cDNA of an Olea europaea CYP450 gene, based on a previously identified 5' fragment was achieved in this study via the method of 3’ RACE-PCR. The isolated gene of Olea europaea (CYP71A- Olea) consists of 1647 nucleotides, contains an open reading frame of 1524 nucleotides encoding a polypeptide of 507 amino acid residues. BLASTX analysis has shown that the gene is classified in the family of 71 and in the subfamily A of the plants cytochromes P450, whose members are primarily involved in the biosynthesis of monoterpenes in various plant species. For the characterisation of the protein CYP71A- Olea, expression of the protein in a heterologous system was performed. The CYP71A- Olea ORF was cloned into the pET28a and pQE30 expression vectors in bacteria Escherichia coli. The desired protein was expressed in both constructs but not in the soluble fraction as seen by the SDS-PAGE analysis. Several growth and induction conditions were tested with the aim to express the protein in the soluble fraction but none of them was proved the suitable. The expression of the CYP71A- Olea, protein, in E.coli was examined by western analysis but no signal was detected in any of the samples, so it is difficult to conduct safe conclusions.