Title: Isolation and identification of the indigenous bacterial microflora from vineyards of wine-producing zones PDO "Nemea" and PDO "Peza".
Lactic acid bacteria are responsible for conducting the malolactic fermentation in wine. As a process, refers to the conversion of malic acid to lactic acid via decarboxylation, resulting in a slight increase in pH (Bartowsky et al., 2002; Henick-Kling, 1993; Henschke, 1993; Lonvaud-Funel, 2002). Furthermore, it has been shown that malolactic fermentation provides the wine with positive organoleptic characteristics, improving the taste and texture, and microbiological stability (Agouridis, Bekatorou, Nigam and Kanellaki, 2005; Costantini et al., 2009; López et al., 2011; Maicas, 2001; Malherbe et al., 2012). While the main bacterium for completing malolactic fermentation belongs to the species of Oenococcus oeni, (Costantini et al., 2009; Liu, 2002; Versari et al., 1999), studies have shown that species of the genera Lactobacillus and Pediococcus manage to adapt to and in some cases, to develop more effectively than Oenococcus oeni, even before completion of the alcoholic fermentation (du Plessis et al., 2004; Izquierdo, Ruiz, Sesera and Palop, 2009; Ribireau-Gayon, Glories, Maujean and Dubourdieu, 2000).
In recent years, winemakers, as well as research community, have started to become more and more concerned for the spontaneous fermentation of wines. This is because, unlike the guided fermentations, during spontaneous fermentations the developed indigenous species of the vineyard, can impart the organoleptic characteristics of the wine. As in the case of spontaneous alcoholic fermentations, in spontaneous malolactic fermentations, the types of bacteria that will be present in the process and that they will eventually manage to survive, at the end of alcoholic fermentation, so, if it becomes possible, to perform malolactic, can’t be controlled. Whatever the final result, the use of starter cultures of selected indigenous yeasts and / or bacteria in order to carry out fermentative processes, is a very interesting project, which may result in production of wine with accented characteristics of the geographical area of origin, the so called microbiology terroir (Ruiz, et al., 2010).
For this reason, the identification and characterization of indigenous species is a vital process for finding species / strains with enological potential. Among the various identification methods developed in recent years, the most rapid and reliable methods
10
are based on the principle of polymerase chain reaction (PCR), (Delley et al., 2002; Roy et al., 2001; Ventura et al., 2001).
The purpose of this Master Thesis was firstly the isolation of the indigenous bacteria from grape samples, which underwent spontaneous fermentation, from two wine-producing areas PDO “Peza” and “Nemea” and then their identification to species level using molecular techniques. The ultimate goal was to find indigenous bacterial species that could survive, during alcoholic fermentation, and that could possibly carry out, in a subsequent step, the malolactic fermentation.
For this purpose, indigenous bacteria were isolated from 14 must samples derived from the wine-producing zone PDO “Peza”, in Crete, and from 31 must samples, derived from the wine-producing zone PDO “Nemea”, in Peloponnese. In the case of Peza zone, the samples came from the varieties Vilana, Kotsifali and Mandilari, whereas in the zone of Nemea, from the variety Aghiorghitiko. Isolation took place in three stages, during spontaneous alcoholic fermentation, which corresponded to the beginning (stage BF), to the middle (stage MF) and to the end (stage EF) of the procedure and then in one more stage, after alcoholic fermentation, in order to study malolactic fermentation (stage MLF). For the identification of the isolated strains, the technique of 16S amplified ribosomal DNA restriction analysis - ARDRA (Rodas, Ferrer and Pardo, 2003), was used. For the separation of bacterial species Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pentosus and Lactobacillus paraplantarum, an additional multiple PCR, (Torriani, Felis and Dellaglio, 2001) was used. Finally, in order to confirm the patterns identified, a representative from the group of each bacterial species was subjected to sequencing analysis.
From the overall 125 strains of Gram positive and catalase-negative bacteria, isolated from the Peza zone and of the overall 254, isolated from the zone of Nemea, 7 species of bacteria (Streptococcus sp., Lactococcus lactis, Weissella minor, Staphylococcus epidermidis, Lactobacillus graminis, Pediococcus pentosaceus and Lactobacillus plantarum) were emerged. 5 of these 7 species (Streptococcus sp., Lactococcus lactis, Weissella minor, Staphylococcus epidermidis and Lactobacillus graminis) weren’t considered to play an important role in the malolactic fermentation. The species Pediococcus pentosaceus and Lactobacillus plantarum, on the other hand, were considered as the most resistant to the harsh conditions of alcoholic fermentation (low
11
pH, high ethanol concentration, etc.). The species Pediococcus pentosaceus was isolated from all stages of the fermentation process, with greater presence in the first two stages of alcoholic fermentation (stage BF and stage MF). Finally, the species Lactobacillus plantarum, was presented as the overriding isolated bacterial species, as it was isolated in sufficient population from all stages of the fermentation process, except from the stage BF, while was prevailed in stage EF and stage MLF, in both geographic areas. Although the most resistant species in this category, Oenococcus oeni, wasn’t isolated from any sample in this study.
In conclusion, the species Pediococcus pentosaceus and Lactobacillus plantarum showed high survival ability throughout the course of alcoholic fermentation. Their continuous presence after the stage EF, may indicate their ability to take an active role in the malolactic fermentation, which follows. Further research is needed to identify / distinguish isolates at the strain level and to assess their technological characteristics.
Τίτλος: Απομόνωση και ταυτοποίηση της ενδογενούς βακτηριακής μικροχλωρίδας από αμπελώνες των ζωνών παραγωγής των οίνων ΠΟΠ «Νεμέα» και ΠΟΠ «Πεζά».
Τα βακτήρια του γαλακτικού οξέος είναι υπεύθυνα για τη διεξαγωγή της μηλογαλακτικής ζύμωσης στον οίνο. Σαν διαδικασία αφορά στη μετατροπή του μηλικού οξέος σε γαλακτικό, μέσω αποκαρβοξυλίωσης, η οποία καταλήγει σε μικρή αύξηση του pH (Bartowsky et al., 2002; Henick-Kling, 1993; Henschke, 1993; Lonvaud-Funel, 2002). Επιπλέον, έχει αποδειχθεί ότι προσδίδει στον οίνο θετικά οργανοληπτικά χαρακτηριστικά, βελτιώνοντας τη γεύση και την υφή, αλλά και μικροβιολογική σταθερότητα (Agouridis et al., 2005; Costantini et al., 2009; López et al., 2011; Maicas, 2001; Malherbe et al., 2012). Αν και το κύριο βακτήριο της μηλογαλακτικής ζύμωσης ανήκει στο είδος Oenococcus oeni, (Costantini et al., 2009; Liu, 2002; Versari et al., 1999), έρευνες έχουν δείξει ότι, είδη των γενών Lactobacillus και Pediococcus καταφέρνουν να προσαρμοστούν ικανοποιητικά και, σε μερικές περιπτώσεις, να αναπτυχθούν πιο αποτελεσματικά από το Oenococcus oeni, πριν ακόμα ολοκληρωθεί η αλκοολική ζύμωση (du Plessis et al., 2004; Izquierdo, Ruiz, Seseρa and Palop, 2009; Ribιreau-Gayon, Glories, Maujean and Dubourdieu, 2000).
Τα τελευταία χρόνια, άρχισε να γίνεται όλο και μεγαλύτερο το ενδιαφέρον των οινοποιών, αλλά και της ερευνητικής κοινότητας, για τις αυθόρμητες ζυμώσεις οίνων. Αυτό γιατί, αντίθετα από τις κατευθυνόμενες ζυμώσεις, κατά τις αυθόρμητες ζυμώσεις αναπτύσσονται ενδογενή είδη του αμπελώνα που μπορεί να προσδώσουν ιδιαίτερα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά στους παραγόμενους οίνους. Όπως και στην περίπτωση της αλκοολικής ζύμωσης όμως, έτσι και στην αυθόρμητη μηλογαλακτική ζύμωση, δεν μπορεί να ελεγχθεί ποια είδη βακτηρίων θα είναι παρόντα στη διαδικασία και ποια τελικά θα καταφέρουν να επιβιώσουν στο πέρας της αλκοολικής ζύμωσης, ώστε αν καταστεί δυνατό να την πραγματοποιήσουν. Όποιο και αν είναι τελικά το αποτέλεσμα, η χρήση εναρκτήριων καλλιεργειών επιλεγμένων ενδογενών ζυμών ή / και βακτηρίων για τη διεξαγωγή των ζυμωτικών διαδικασιών, αποτελεί ένα πολύ ενδιαφέρον εγχείρημα, το οποίο δύναται να καταλήξει σε παραγωγή οίνου με τονισμένα τα χαρακτηριστικά της γεωγραφικής περιοχής προέλευσης, το λεγόμενο μικροβιολογικό terroir (Ruiz, et al., 2010).
7
Γι’ αυτό το λόγο, η ταυτοποίηση και ο χαρακτηρισμός των αυτόχθονων ειδών αποτελεί μία διαδικασία πρωταρχικής σημασίας, για την εύρεση ειδών / στελεχών με οινολογικό δυναμικό. Μεταξύ των διαφόρων μεθόδων ταυτοποίησης που αναπτύχθηκαν τα τελευταία χρόνια, οι πιο ταχείες και αξιόπιστες μέθοδοι στηρίζονται στην αρχή της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR), (Delley et al., 2002; Roy et al., 2001; Ventura et al., 2001).
Ο σκοπός της συγκεκριμένης μεταπτυχιακής μελέτης ήταν αρχικά η απομόνωση αυτόχθονων βακτηρίων από δείγματα γλεύκους, τα οποία υποβλήθηκαν σε αυθόρμητη ζύμωση, από δύο ζώνες παραγωγής οίνων ΠΟΠ, στην Κρήτη και στη Νεμέα και στη συνέχεια, η ταυτοποίησή τους σε επίπεδο είδους, με χρήση μοριακών τεχνικών. Ο απώτερος στόχος ήταν η εύρεση αυτόχθονων βακτηριακών ειδών με δυνατότητα επιβίωσης, κατά τη διάρκεια της αλκοολικής ζύμωσης και δυνατότητα πραγματοποίησης, σε ένα μετέπειτα στάδιο, της μηλογαλακτικής ζύμωσης.
Γι’ αυτό το σκοπό, αυτόχθονα βακτήρια απομονώθηκαν από 14 δείγματα γλεύκους, προερχόμενα από τη ζώνη παραγωγής οίνων ΠΟΠ των Πεζών, στην Κρήτη, και από 31 δείγματα γλεύκους, προερχόμενα από τη ζώνη παραγωγής οίνων ΠΟΠ της Νεμέας, στην Πελοπόννησο. Στην περίπτωση της ζώνης των Πεζών, τα δείγματα προέρχονταν από τις ποικιλίες Βηλάνα, Κοτσιφάλι και Μαντηλάρι, ενώ στην περίπτωση της ζώνης της Νεμέας, από την ποικιλία Αγιωργίτικο. Οι απομονώσεις έλαβαν χώρα σε τρία στάδια της αυθόρμητης αλκοολικής ζύμωσης, τα οποία αντιστοιχούσαν στην αρχή (στάδιο BF), στη μέση (στάδιο MF) και στο τέλος (στάδιο EF) αυτής και έπειτα σε ένα ακόμα στάδιο, μετά το πέρας της αλκοολικής ζύμωσης, για τη μελέτη της μηλογαλακτικής (στάδιο MLF). Για την ταυτοποίηση στελεχών, που απομονώθηκαν, χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της ανάλυσης περιορισμού του ενισχυμένου 16S ριβοσωμικού DNA (16S amplified ribosomal DNA restriction analysis - ARDRA) ), (Rodas, Ferrer and Pardo, 2003). Για το διαχωρισμό των βακτηριακών ειδών Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pentosus και Lactobacillus paraplantarum, χρησιμοποιήθηκε επιπλέον μία πολλαπλή (multiplex) PCR, (Torriani, Felis and Dellaglio, 2001). Τέλος, για την επιβεβαίωση των προτύπων που ταυτοποιήθηκαν, ένας αντιπρόσωπος από την ομάδα του κάθε βακτηριακού είδους, υποβλήθηκε σε ανάλυση αλληλούχισης.
8
Από τα 125 συνολικά στελέχη Gram θετικών και αρνητικών στην καταλάση βακτηρίων, που απομονώθηκαν από τη ζώνη των Πεζών και από τα 254 συνολικά, που απομονώθηκαν από τη ζώνη της Νεμέας, προέκυψαν 7 είδη βακτηρίων (Streptococcus sp., Lactococcus lactis, Weissella minor, Staphylococcus epidermidis, Lactobacillus graminis, Pediococcus pentosaceus και Lactobacillus plantarum). Από τα 7 αυτά είδη, τα 5 (Streptococcus sp., Lactococcus lactis, Weissella minor, Staphylococcus epidermidis και Lactobacillus graminis) δεν θεωρήθηκε ότι δύνανται να παίξουν σημαντικό ρόλο στη μηλογαλακτική ζύμωση. Τα είδη Pediococcus pentosaceus και Lactobacillus plantarum, από την άλλη, δύναται να θεωρηθούν τα πιο ανθεκτικά στις αφιλόξενες συνθήκες της αλκοολικής ζύμωσης (χαμηλό pH, υψηλή συγκέντρωση αιθανόλης, κ.α.) από τα 7 που απομονώθηκαν. Το είδος Pediococcus pentosaceus απομονώθηκε απ’ όλα τα στάδια της ζυμωτικής διαδικασίας, με μεγαλύτερη παρουσία στα πρώτα δύο στάδια της αλκοολικής ζύμωσης (στάδιο BF και στάδιο MF). Τέλος, το είδος Lactobacillus plantarum, παρουσιάζεται ως το υπερέχων απομονωμένο βακτηριακό είδος, καθώς απομονώθηκε σε επαρκή πληθυσμό απ’ όλα τα στάδια της ζυμωτικής διαδικασίας, εκτός του σταδίου BF, ενώ υπερίσχυσε και στο στάδιο της αποζύμωσης, αλλά και της μηλογαλακτικής ζύμωσης, και στις δύο γεωγραφικές περιοχές. Αν και το πιο ανθεκτικό βακτήριο της κατηγορίας, το είδος Oenococcus oeni, δεν απομονώθηκε από κανένα δείγμα της συγκεκριμένης μελέτης.
Συμπερασματικά, τα είδη Pediococcus pentosaceus και Lactobacillus plantarum παρουσιάζουν μεγάλη ικανότητα επιβίωσης καθ’ όλη τη διάρκεια της αλκοολικής ζύμωσης. Η παρουσία τους και μετά το πέρας αυτής, ίσως υποδηλώνει και την ικανότητα τους να λάβουν ενεργό ρόλο στην μηλογαλακτική ζύμωση, που ακολουθεί. Περαιτέρω έρευνα απαιτείται για την ταυτοποίηση / διάκριση των απομονώσεων σε επίπεδο στελέχους και την αξιολόγηση των τεχνολογικών τους χαρακτηριστικών.
