Μελέτη της παραγωγής μυκηλιακής μάζας, ενζύμων και βιολογικών ενεργών μεταβολικών προϊόντων κατά την αύξηση μυκήτων σε υπολείμματα και παραπροϊόντα της βιομηχανίας τροφίμων

Abstract

Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη διαφόρων υπολειμμάτων και υποπροϊόντων της βιομηχανίας τροφίμων ως υποστρώματα για την ανάπτυξη μυκήτων και την παραγωγή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας. Ειδικότερα, διερευνήθηκαν οι προοπτικές αξιοποίησης των στερεών υπολειμμάτων από την βιομηχανική οινοποίηση -στέμφυλα και οινολάσπη- και του τυρογάλακτος, μέσω της χρήσης μυκήτων του γένους Pleurotus, Aspergillus και Mortierella για την παραγωγή χρήσιμων ενζύμων και υψηλής αξίας μικροβιακού λίπους. Αρχικά, μελετήθηκαν δύο είδη του γένους Pleurotus, τα P. ostreatus και P. pulmonarius σε ζυμώσεις στερεής, ημι-στερεής και υγρής κατάστασης με υπόστρωμα τα στέμφυλα οινοποιίας. Η συγκριτική τους αξιολόγηση βασίστηκε στην ικανότητά τους να αξιοποιούν το υπόστρωμα αποδομώντας τα φαινολικά συστατικά, στην παραγωγή μυκηλιακής μάζας και στην παραγωγή των ενζύμων λακκάση και ενδογλυκανάση. Οι μετρήσεις των φαινολικών συστατικών του υποστρώματος έδειξαν ότι αυτοί οι μύκητες είναι ικανοί να διασπάσουν έως και το 80% των φαινολικών, ανεξαρτήτως του είδους του μύκητα και τις συνθήκες καλλιέργειας. Αντιθέτως, η παραγωγή της βιομάζας έδειξε ότι επηρεάζεται τόσο από το είδος του μύκητα όσο κι από το είδος της καλλιέργειας, καθώς οι μέγιστες τιμές (P. pulmonarius: 0,54 g/g ξ. υπ. και P. ostreatus: 0,50 g/g) σημειώθηκαν κατά την υγρή καλλιέργεια. Παρομοίως επηρεάστηκε και η παραγωγή των ενζύμων, καθώς η λακκάση έλαβε την μέγιστη τιμή της, περίπου 26.000 U/g, κατά την στερεή καλλιέγεια του P. ostreatus και η μεγαλύτερη ενεργότητα ενδογλυκανάσης, 96U/g, καταγράφηκε κατά την υγρή καλλιέργεια του ίδιου μύκητα. Στο τελευταίο πείραμα που αφορά στην αξιοποίηση των στεμφύλων πραγματοποιήθηκε στερεή καλλιέργεια των δύο μυκήτων προς παραγωγή μανιταριών με ικανοποιητική απόδοση που έφθασε το 14% για τον P. pulmonarius. Στη συνέχεια των πειραμάτων, πραγματοποιήθηκαν ζυμώσεις στερεής κατάστασης με τον μύκητα Aspergillus oryzae για να αξιοποιηθεί το εξαντλημένο υπόστρωμα μανιταριών σε συνδυασμό με οινολάσπη, ως πλούσια πηγή αζώτου. Κατόπιν βελτιστοποίησης των συνθηκών ζύμωσης διαπιστώθηκε ότι η μέγιστη παραγωγή των πρωτεολυτικών ενζύμων (~ 138 U/g) του εν λόγω μύκητα, επισυνέβη σε υπόστρωμα με αναλογία εξαντλημένου υποστρώματος μανιταριών:οινολάσπης 50:50, με αρχική υγρασία υποστρώματος 65% και στις 66 h ώρες ζύμωσης. Η ικανότητα των πρωτεολυτικών αυτών ενζύμων μελετήθηκε πραγματοποιώντας ενζυμική υδρόλυση της οινολάσπης, με στόχο την παραγωγή υδρολύματος πλούσιο σε άζωτο ελεύθερων αμινομάδων (FAN). Η μέγιστη παραγωγή FAN που επιτεύχθη ήταν 236 mg/L. Στο τελευταίο πειραματικό στάδιο αυτής της μελέτης, διερευνήθηκε η δυνατότητα αξιοποίησης του υδρολύματος ως πηγή αζώτου σε συνδυασμό με μία χαμηλού κόστους πηγή άνθρακα, όπως είναι τα απόβλητα τυρογάλακτος μέσω υγρής ζύμωσης του μύκητα Mortierella ramanniana. Αρχικά, πραγματοποιήθηκαν δύο υγρές καλλιέργειες σε κωνικές φιάλες με αρχική συγκέντρωση 80 g/L λακτόζη και με διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις FAN (160 και 200 mg/L). Η ζύμωση κατευθύνθηκε προς την παραγωγή λιπιδίων σημειώνοντας σημαντική συσσώρευση λίπους, ήτοι 8,2-8,6 g/L με περιεκτικότητα 0,29-0,35 g/g βιομάζας. Τέλος, από την πραγματοποίηση του ίδιου πειράματος σε βιοαντιδραστήρα το μικροβιακό λίπος και η περιεκτικότητα της βιομάζας ήταν 9,2-9,5 g/L και 0,30-0,36 g/g αντίστοιχα.

The aim of the present thesis was the study of various wastes derived from food industry as substrates for fungal growth and the production of high-added value products. In particular, the study was focused on the potential evaluation of solid winery wastes -grape pomace and wine lees- through the microbial fermentation by Pleurotus, Aspergillus and Mortierella species in order to produce enzymes and microbial oil. At first, two Pleurotus species, P. ostreatus and P. pulmonarius, were studied during their solid-, semi solid-state and submerged fermentation on grape pomace as a substrate. The comparative evaluation between the species and the different fermentations was based on their ability to exploit the substrate via the consumption of phenolic compounds, the production of mycelia mass and enzyme production. Phenolic components measurements showed that these fungi was able to break up to 80%, regardless of the fungi species and culture conditions. Conversely, the production of biomass showed influenced of both species and culture conditions and the maximum values occurred (P. pulmonarius: 0.54 g/g d.b. and P. ostreatus: 0.50 g/g) in the submerged fermentation. The production of enzymes was similarly affected, laccase reached a maximum activity of 26.000U/g during the solid state fermentation of P. ostreatus and high endoglucanase activity was recorded at the submerged fermentation of the same fungi. In the last experiment, concerning the utilization of grape pomace, a solid state fermentation for mushroom production was conducted recording satisfactory yields (14% for P. pulmonarius). In the following experiments solid state fermentations by Aspergillus oryzae were carried out in order to utilize the spent mushroom substrate in combination with wine lees, as a rich source of nitrogen. After optimization of fermentation conditions established that the maximum production of proteolytic enzymes (~138 U/g) occurred when the substrate ratio of spent mushroom substrate:wine lees was 50:50, at initial moisture 65% in 66 hours of the fermentation. The ability of these proteolytic enzymes was studied by performing enzymatic hydrolysis of wine lees, with the aim of producing a rich in free amino nitrogen (FAN) hydrolyzate. The highest production was 236 mg/L FAN. In the last experimental phase of the present study, we investigated the possibility of utilize the hydrolyzate as nitrogen source in combination with a low cost carbon source, such as waste of cheese whey performing submerged fermentation by Mortierella ramanniana fungi. Fermentations were conducted in shake flaks at an initial concentration of 80 g/L lactose and with diffirent concentrations of FAN (160 and 200 mg/L). Fermentation was directed toward the lipid biosynthesis recording significant oil accumulation, that is 8.2 and 8.6 g/L and the intracellular content was 0.29 and 0.35 g/g biomass. Finally, the same culture conditions were applied in a bioreactor and the microbial oil was 9.2 and 9.5 g/L and the concentration of biomass in lipids was 0.30 and 0.36 g/g.