Characterization of antibodies for the detection of celery in food.

Abstract

Τα αυξανόμενα κρούσματα αλλεργίας από κατανάλωση τροφίμων οδήγησαν την Ευρωπαϊκή Αρχή Ασφάλειας Τροφίμων (EFSA) στη θέσπιση του κανονισμού 2007/68/EC που κάνει υποχρεωτική τη σήμανση αλλεργιογόνου συστατικού στην ετικέτα του τροφίμου. Μεταξύ άλλων στη λίστα των συστατικών που προκαλούν αλλεργιογόνες αντιδράσεις συγκαταλέγεται και το σέλινο. Ως εκ τούτου η βιομηχανία τροφίμων αντιμετωπίζει το πρόβλημα σχεδιασμού πολύπλοκων και ακριβών συστημάτων διαχείρισης των αλλεργιογόνων και ειδικότερα του σέλινου εφόσον δεν υπάρχουν εύκολες και φτηνές ανοσολογικές μέθοδοι ανίχνευσης και ποσοτικού προσδιορισμού του. Ο μέχρι τώρα τρόπος ανίχνευσης του σέλινου είναι η PCR, μέθοδος που απαιτεί εκπαιδευμένο (εξειδικευμένο) προσωπικό και ακριβό εργαστηριακό εξοπλισμό, ενώ η ανάλυση περιορίζεται αυστηρά στον εργαστηριακό χώρο. Στόχος της εργασίας ήταν η ανάπτυξη μιας ανοσοενζυμικής μεθόδου ανίχνευσης σέλινου. Είναι γνωστό από τη βιβλιογραφία ότι στο σέλινο υπάρχουν διάφορα αλλεργιογόνα μόρια, ένα εκ των οποίων αποτελεί η πρωτεΐνη Api g 1, η οποία βρίσκεται σε ποσοστό 20 % στο σύνολο των πρωτεϊνών στο σέλινο και υπάρχει σε δύο ισομορφές, την Api g 1.01 και την Api g 1.02. Η πρωτεΐνη αυτή παράχθηκε βακτηριακά από εισαγωγή πλασμιδίου στο γονιδίωμα του E.coli με σκοπό να χρησιμοποιηθεί στα πειράματα. Σε ένα πρώτο σχήμα ανοσοποιήθηκαν δώδεκα κουνέλια. Χρησιμοποιήθηκαν σέλινο, πρωτεϊνικό εκχύλισμα από σέλινο, ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη Api g 1 και ένα μίγμα πέντε πεπτιδίων (όλα τμήματα από την πρωτεϊνική ακολουθία της Api g 1.01) για την ανοσοποίηση των ζώων. Σε ένα άλλο δεύτερο σχήμα ανοσοποίησης, τέσσερα άλλα κουνέλια εμβολιάστηκαν το καθένα με ένα διαφορετικό πεπτίδιο. Τα δύο πεπτίδια αποτελούσαν τμήμα από την πρωτεϊνική ακολουθία της Api g 1.01 και τα άλλα δύο από την ισομορφή Api g 1.02. Σε αυτά τα τέσσερα ζώα, τα μόρια για την ανοσοποίηση ήταν μικρά αλλά επιλεγμένα έτσι ώστε η πρωτεϊνική ακολουθία να μην παρουσιάζει ομολογίες με πρωτεΐνες άλλων συγγενικών προς το σέλινο φυτών. Εργαστηριακά χρησιμοποιήθηκε μια στήλη καθαρισμού ανοσοσυγγένειας πάνω στην οποία ήταν ακινητοποιημένη η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη Api g 1. Σκοπός ήταν η απομόνωση αντισωμάτων ικανών να ενώνονται ειδικά και συγκεκριμένα με την αλλεργιογόνο πρωτεΐνη. Όταν εξετάστηκαν σε τεστ Indirect-ELISA και κατόπιν σε Western Blot, για να προσδιοριστεί η ικανότητα τους να ενωθούν με το πρωτεϊνικό εκχύλισμα της σελινόριζας και με τη ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη Api g 1 αντίστοιχα, έδειξαν επιτυχή ένωση με την αλλεργιογόνα πρωτεΐνη. Τα αντισώματα έδειξαν υψηλό βαθμό καθαρότητας. Από τη βιβλιογραφία είναι γνωστό ότι η πρωτεΐνη Api g 1 στην ηλεκτροφόρηση παρουσιάζεται στο δείκτη μοριακού βάρους των 15 kDa. Στα Western Blot τεστ παρατηρήθηκε αυτή η πρωτεΐνη στο χαρακτηριστικό ύψος της πηχτής, γεγονός που μας επιτρέπει να συμπεράνουμε ότι η ικανότητα των αντισωμάτων να ενώνονται με τη σελινόριζα οφείλεται σε συγκεκριμένη ένωση με την αλλεργιογόνα πρωτεΐνη Api g 1. Τα αντισώματα τα οποία έδειξαν τη μεγαλύτερη τάση ένωσης επιλέχθηκαν για να χρησιμοποιηθούν σε μετέπειτα πειράματα Sandwich-ELISA ως επισημασμένο πρώτο αντίσωμα. Ως δεύτερο επισημασμένο αντίσωμα στο Sandwich-ELISA επιλέχθηκε ένα αντίσωμα (antiApi1-2Βiotin) το οποίο αποκτήθηκε όταν ορός από το ζώο το οποίο είχε ανοσοποιηθεί με πεπτίδιο(aa121-140), τμήμα από την Api g 1.01 πέρασε μέσα από τη στήλη ανοσοσυγγένειας και στη συνέχεια συζεύτηκε με βιοτίνη έτσι ώστε να είναι εύκολη η ανίχνευσή του. Πριν αναπτυχθεί το σύστημα Sandwich-ELISA έγιναν πειράματα ώστε να εξακριβωθεί αν το συγκεκριμένο αντίσωμα (antiApi1-2Biotin) δείχνει προτίμηση ένωσης με το σέλινο ή αν ενώνεται και με πρωτεΐνες άλλων φυτών με παρόμοια πρωτεϊνική ακολουθία. Όταν ίσες ποσότητες σελινόριζας, καρότου και μαϊντανού χρησιμοποιήθηκαν για να εξακριβωθεί η συμπεριφορά του συγκεκριμένου αντισώματος, αυτό επέδειξε ικανότητα να ενώνεται ειδικά με τη σελινόριζα και όχι με το καρότο και το μαϊντανό. Στο Sandwich-ELISA τεστ που ακολούθησε, το παραπάνω αντίσωμα έδειξε να ενώνεται πολύ καλά με τη ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη Api g 1, δεν κατάφερε όμως να εφαρμοστεί στη περίπτωση του Api g 1 στη φυσική του μορφή ως συστατικού της σελινόριζας, γεγονός το οποίο μπορεί να οφείλεται στην αναδίπλωση της πρωτεΐνης μέσα στη σελινόριζα. Εφόσον κάτω από αυτές τις συνθήκες ένα τέτοιο σύστημα δεν ήταν εφικτό, έγινε προσπάθεια να εξακριβωθεί η εφαρμογή του αντισώματος antiApi1-2Biotin σε Indirect-ELISA τεστ. Σε μια προσπάθεια προσέγγισης της πραγματικότητας όπου το σέλινο βρίσκεται μονάχα σε ίχνη μέσα στο τρόφιμο ενώ το καρότο σε μεγαλύτερες συγκεντρώσεις, χρησιμοποιήθηκαν σε δοκιμή Indirect-ELISA δεκαπλάσιες συγκεντρώσεις καρότου και μαϊντανού. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι δεν ήταν εφικτή η διάκριση, οπότε η χρήση του αντισώματος είναι περιορισμένη. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε τρόφιμα που ως γνωστό δεν περιέχουν καρότο, όπως για παράδειγμα μαρινάδες για κρέας. Επίσης μια άλλη πιθανή εφαρμογή του, θα ήταν για τον έλεγχο καθαρισμού σε μονάδες τροφίμων που επεξεργάζονται σέλινο. Μετά από ένα σωστό καθαρισμό, στα νερά απορροής δεν θα πρέπει να ανιχνεύονται ίχνη ούτε από σέλινο ούτε από καρότο. Σε μια προσπάθεια παραλαβής άλλων αντισωμάτων ικανών να χρησιμοποιηθούν για την ανάπτυξη ενός συστήματος βασιζόμενο στο Sandwich-ELISA πρότυπο, οροί των ζώων που είχαν ανοσοποιηθεί κατά του σέλινου, πέρασαν μέσα από στήλη καθαρισμού ενεργοποιημένης σεφαρόζης ενωμένης με πρωτεϊνικό εκχύλισμα σέλινου. Σκοπός ήταν η απομόνωση αντισωμάτων με ευαισθησία ένωσης ειδικά με το σέλινο. Τα αντισώματα αυτά σε τεστ Indirect-ELISA και Western Blot έδειξαν να ενώνονται χωρίς ιδιαίτερη επιλεκτικότητα, με πολλές πρωτεΐνες της σελινόριζας αλλά και του καρότου. Στο μέλλον θα πρέπει να εξεταστεί πως θα καταστρωθεί ένα ELISA σύστημα για να συμπληρωθεί το ήδη υπάρχoν σύστημα. Ενδεχομένως πρέπει γίνουν επιπρόσθετες ανοσοποιήσεις. Πρέπει να ευρεθούν μικρά πεπτίδια για την ανοσοποίηση, τα οποία δεν εφαρμόζουν ομολογίες με άλλες πρωτεΐνες φυτών και τα οποία είναι σταθερά στη θερμοκρασία έτσι ώστε να μπορούν να χρησιμοποιηθούν και σε θερμοκρασιακά επεξεργασμένα τρόφιμα. Παράλληλα πρέπει να μελετηθεί η ανοσοποίηση άλλων ζώων, όχι κουνελιών, τα οποία αντιδρούν στη σελινόριζα με μεγαλύτερο αριθμό αντισωμάτων.

The increasing number of people suffering from symptoms related to food allergies and the EFSA Directive 2007/68/EC makes European manufacturers sceptical about the allergen-management politics they have to follow. This lead some companies to include expensive and complicated detection methods into their routine analysis, while others turned to the over labelling of their products. Celery is one of the foods that causes allergy, especially in central Europe and is according to the above Directive labelling obligatory. In the present situation some PCR methods have been developed for the detection of celery allergens. Immunological detection methods, which are very common in food allergen detection, have not yet been developed for celery. In the work presented, the aim was to establish such a detection system. In this regard rabbits were immunized in two different schemes with different immunization agents. Celery raw material, celery protein extract, recombinant celery allergen Api g 1, individual Api g 1.01 and Api g 1.02 specific peptides as well as an immunogenic Api g 1 specific peptide mix, were used to immunize the rabbits and to get specific antibodies against the immunogens. The antisera gained by these immunizations, were subjected to immunoaffinity purification using immobilized Api g 1 protein. These purified polyclonal antibodies showed a good binding ability according to results from Indirect-ELISA assays, which were further confirmed by immunoblotting. The Western Blots revealed a dominant band at 15 kDa in celeriac protein extracts and at 16 kDa with recombinant Api g 1 due to its His-tag. Sera-antibodies were not specific. One of the purified antibodies (antiApi1-2), which was obtained by immunization with the peptide aa121-140, part of the Api g 1.01 protein, got conjugated with Biotin in order to be used as detection antibody. Some allergens show cross reactivity with other plant proteins due to their protein sequence homology. In order to check if the above gained and conjugated antibody showed such a tendency, ELISA tests were performed with equal concentrations of celeriac, carrot, and parsley protein extracts. A clear differentiation was possible showing the specificity of the antibody. In order to establish a Sandwich-ELISA this antibody was combined with antibodies from the first immunization scheme, especially with the sera from animals 9/10 (immunized with recombinant Api g 1) and animals 11/12 (immunized with the Api g 1 specific peptide mix) acting as capture agents. Firstly the antigen recombinant protein Api g 1 was tested. In a second step a Sandwich-ELISA test with celeriac protein extract was examined. During the course of the project it got obvious that the Sandwich-ELISA established in that way was able to detect the recombinant Api g 1 protein specific and sensitive but not the native Api g 1 protein present in celery extract. In order to understand how the Indirect-ELISA-test with the biotinilated antibody antiApi1-2 would work, in systems which carrot´s and parsley´s concentration were high, further tests were performed. At a 10-fold higher concentration of carrot and parsley protein extracts (50 μg/ml), this antibody showed a high degree of cross reactivity, a fact that would be problematic in a multicomponent food. By immunoblots it could be shown that the only interfering factor was a protein at 16 kDa which corresponds to DauC1, the major protein allergen in carrot. To gain antibodies that could be used to establish a stable Sandwich-ELISA, antisera of animals 1, 4, 5, 6, 7, 8, were subjected to purification with sepharose on which whole celery protein was immobilized. These animals were immunized against celeriac. During Indirect-ELISA-tests they showed less reactivity towards recombinant Api g 1, high reactivity towards celery protein but also against carrot protein. Performing immunoblotting these antibodies showed complex banding patterns in celery and carrot extracts and therefore could not be used as specific agents in Sandwich-ELISAs because of their obvious low specificity. Summarizing the results, one can conclude that the antibody antiApi1-2 as shown in an Indirect-ELISA test could have some application. The detection of celery in a multicomponent food with high concentrations of carrot would not have a reliable specificity. Therefore this antibody might be used for complex foods that do not include carrot. In addition it would be useful to examine if the system can be applicable in the cleaning procedure of the food industry. Traces of detectable celery, even carrot, would indicate insufficient cleaning and would help manufacturers to optimize their validations and plan their cleaning steps more effectively. In the future, improvements could be made by new immunization schemes. In order to minimize cross reactivity, new peptides of the antigen´s protein sequence, which do not have high sequence homology with other plant proteins, have to be carefully selected and used as immunization agents. Moreover it should be considered to immunize animal species which would correspond with an extensive immune response towards these celery allergens. New antibodies could be combined with the already gained antibodies in order to establish an improved Sandwich-ELISA test.