Μελέτη της διαγονιδιακής έκφρασης της χαρπίνης HrpZpsph σε φυτά Nicotiana benhamiana κάτω από συνθήκες αβιοτικών καταπονήσεων.

Abstract

Οι βιοχημικές αλλαγές καθώς και τα επαγόμενα υπό την επίδραση των αβιοτικών καταπονήσεων γονίδια αποτελούν αντικείμενο έρευνας, με απώτερο στόχο τη δημιουργία ανθεκτικών διαγονιδιακών φυτών. Οι βακτηριακής προέλευσης πρωτεΐνες- χαρπίνες (Hrp) έπειτα από την ενσωμάτωσή τους σε φυτά είναι ικανές να επάγουν γονίδια σχετιζόμενα με την άμυνα ενάντια σε βιοτικούς και αβιοτικούς παράγοντες καταπόνησης. Προκειμένου να μελετηθεί ο ρόλος της πρωτεΐνης HrpZPsph, του βακτηρίου Pseudomonas syringae pv. phaseolicola κάτω από συνθήκες αβιοτικών καταπονήσεων, παράχθηκαν διαγονιδιακά φυτά του είδους Nicotiana benthamiana. Τα διαγονιδιακά φυτά (Τ2 γενιά) που εξέφραζαν το γονίδιο hrpΖPsph αξιολογήθηκαν σε μορφολογικό και αναπτυξιακό επίπεδο σε σύγκριση με φυτά- μάρτυρες και ακολούθησε έλεγχος για την επαγωγή γονιδίων εμπλεκόμενων με γνωστά μονοπάτια άμυνας των φυτών. Για την αξιολόγηση των μετασχηματισμένων φυτών πραγματοποιήθηκε πολλαπλή PCR αντίδραση για την ενίσχυση του διαγονιδίου hrpZPsph και της περιοχής virG του Α. tumefaciens, RT-PCR για τον έλεγχο της έκφρασης του διαγονιδίου και ανοσοανίχνευση κατά Western για την ανίχνευση και ποσοτικοποίηση της παραγόμενης πρωτεΐνης. Ο μετασχηματισμός επιβεβαιώθηκε σε όλα τα φυτά που εξετάστηκαν τόσο με την ένθεση του διαγονιδίου hrpZPsph όσο και με την επιτυχή μεταγραφή και μετάφραση του στην πρωτεΐνη HrpZPsph. Προκειμένου να αξιολογηθεί η ανθεκτικότητα των διαγονιδιακών φυτών έναντι αβιοτικών καταπονήσεων, τα φυτά υπεβλήθησαν σε τέσσερις παράγοντες καταπόνησης (αλατότητα, ακραίες υψηλές και χαμηλές θερμοκρασίες, επίδραση ακτινοβολίας UV-B). Σε όλα τα πειράματα συμπεριλήφθηκαν και φυτά αγρίου τύπου ως μάρτυρες. Η απόκριση των διαγονιδιακών φυτών στα υπό μελέτη ερεθίσματα αξιολογήθηκε σε σύγκριση με φυτά- μάρτυρες με τον έλεγχο της επαγωγής γονιδίων που εμπλέκονται με γνωστά βιοχημικά μονοπάτια άμυνας των φυτών, διαμέσου αντιδράσεων RT-PCR σε διαφορετικούς κύκλους ενίσχυσης. Ακολούθησε μεταβολομική ανάλυση (GC-MS) για τον προσδιορισμό του μεταβολικού προφίλ των διαγονιδιακών φυτών σε σύγκριση με αυτό των φυτών- μαρτύρων. Η ενδογενής έκφραση της χαρπίνης στην εκκρινόμενη μορφή της εξωκυτταρικά (SPHrpZPsph) επέδρασε θετικά στο φαινότυπο και το ρυθμό ανάπτυξης των φυτών. Η ανάλυση μεταγραφημάτων που σχετίζονται με την άμυνα των φυτών κατέδειξε την επαγωγή της έκφρασης των γονιδίων Col1, hin1, PR1a, PR1b και AOX στα διαγονιδιακά φυτά. Κατά τη μεταβολομική ανάλυση, σημειώθηκε αυξημένη συσσώρευση των μεταβολιτών: 2-κετο-L-γουλονικό οξύ, γαλακτουρονικό οξύ, ραφινόζη, θρεόζη, πορφίνη, γλυκονικό οξύ της λακτόνης και διπεπτίδιο της D-αλανίνης στα διαγονιδιακά φυτά σε σύγκριση με τα φυτά-μάρτυρες.

The biochemical alterations as well as the study of genes which are induced by abiotic stresses constitute a field of constant research, finally aiming at the development of genetically resistant varieties. Harpins constitute a class of bacterial proteins which upon integration into the plant genome are capable of inducing genes related to the resistance mechanisms against both biotic and abiotic stresses. To explore possible sources of broad spectrum transgenic resistance to various abiotic stresses, the HrpZPsph protein from Pseudomonas syringae pv. phaseolicola was expressed in N. benthamiana plants. Transgenic plants (T2 generation) were evaluated at the morphological and physiological level in comparison with wild-type control plants. At the same time, transgenics were evaluated by means of PCR for the amplification of the transgene hrpZPsph, RT-PCR for the amplification of the gene transcript and Western blot analysis for the detection and quantification of the foreign protein. Transgene integration and expression was confirmed in all primary transformants whereas at the same time, immunoblot analysis revealed that HrpZPsph was produced. Transgenic plants (T2) were subjected to a series of abiotic stresses (extreme high and low temperatures, high salinity and UV radiation). Wild type plants of the same age were included as control in all experiments. Following abovementioned treatments, the activation of plant defence pathways, due to harpin expression, was examined by an RT-PCR assay, performed in different amplification cycles. Total RNA was extracted from both stressed and control plants and was subsequently subjected to reverse transcription and RTPCR. The expression of known defence-associated genes was determined as a means to partially profile the transcriptome of transgenic vs wild type plants. In order to profile metabolites in transgenic and control plants, metabolites were extracted from leaves of both stressed and non-stressed plants and subsequently analysed using Gas-chromatography coupled to Mass-spectrometry (GC-MS). Endogenous expression of harpin in its secreted form (SP-HrpZPsph) demonstrated a positive effect on phenotype and growth rate of plants. The analysis of transcripts associated with plants’ defense indicated the induction of gene expression Col1, hin1, PR1a, PR1b and AOX in transgenic plants. Finally, metabolomic analysis revealed higher accumulations of specific metabolites in transgenic plants, compared to control plants, such as: 2-keto-L-gulonic acid, galacturonic acid, raffinose, threose, porphine, gluconic acid lactone and dipeptide of D-alanine.