Μελέτη της βιοτεχνολογικής παραγωγής της 1,3-προπανοδιόλης κατά την αύξηση του μικροοργανισμού Clostridium butyricum σε υποστρώματα με βάση την βιομηχανική γλυκερόλη.

Abstract

Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της φυσιολογικής συμπεριφοράς του βακτηρίου C. butyricum VPI 1718 κατά την καλλιέργεια του σε υποστρώματα με βάση την βιομηχανική γλυκερόλη. Η γλυκερόλη είναι μια ανανεώσιμη πηγή άνθρακα η οποία παράγεται σε διεθνές επίπεδο ως το κύριο υποπροϊόν των βιομηχανιών παραγωγής σαπώνων και οινοπνευματωδών ποτών. Η αλματώδης ανάπτυξη που σημειώνει τα τελευταία χρόνια η βιομηχανία παραγωγής εναλλακτικού τύπου καυσίμων, όπως το βιολογικό πετρέλαιο (βιοντήζελ) και η βιολογική αιθανόλη, έχει ως απόρροια την σημαντική αύξηση των αποθεμάτων της γλυκερόλης, ως ενός υποπροϊόντος (ή/και αποβλήτου) χρήζοντος ανάγκης για περαιτέρω επεξεργασία. Υπό αυτό το πρίσμα, προκειμένου να διαπιστωθεί η καταλληλότητα της βιομηχανικής γλυκερόλης ως υπόστρωμα για την αύξηση του εν λόγω μικροοργανισμού, εξετάστηκε αρχικά η επίδραση που ασκούν οι διάφορες προσμίξεις που δύνανται να βρεθούν στην σύσταση της βιομηχανικής γλυκερόλης. Οι προσμίξεις που εξετάστηκαν αφορούσαν στα φωσφορικά άλατα του καλίου και του νατρίου (Na 2 HPO 4 , K 2 HPO ), στο χλωριούχο νάτριο (NaCl), στη μεθανόλη, καθώς επίσης και στο ελαϊκό οξύ. Κατά την καλλιέργεια του μικροοργανισμού σε στατικές αναερόβιες φιάλες, διαπιστώθηκε ότι, σε αντίθεση με τα φωσφορικά άλατα, η παρουσία του χλωριούχου νατρίου σε συγκέντρωση ίση με 4.5% (κ.β. επί της γλυκερόλης) στο θρεπτικό μέσο άσκησε προφανή παρεμποδιστική επίδραση τόσο επί της αύξησης του βακτηρίου C. butyricum, όσο και της παραγωγής 1,3-προπανοδιόλης. Ωστόσο, κατά την τέλεση της βιοδιεργασίας σε βιοαντιδραστήρα διαλείποντος έργου και την προσθήκη αυξημένων ποσοτήτων χλωριούχου νατρίου (έως 30% κ.β.), δεν παρατηρηθήκαν φαινόμενα επίσχεσης της μικροβιακής αύξησης. Επίσης, ο εν λόγω μικροοργανισμός εμφάνισε ανεκτικότητα στην παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων μεθανόλης κατά την καλλιέργεια του σε βιοαντιδραστήρα διαλείποντος έργου, αλλά και σε συνεχές σύστημα καλλιέργειας, όπου τελέστηκε προσθήκη μεθανόλης, στην κατάσταση δυναμικής ισορροπίας. Ωστόσο, η ύπαρξη του ελαϊκού οξέος στο θρεπτικό μέσο επέδρασε εμφανώς παρεμποδιστικά στην βιοχημική απόκριση του μικροοργανισμού, ενώ το όριο ανεκτικότητας του ως προς το εν λόγω λιπαρό οξύ προσδιορίστηκε στο 1% (κ.β.). Επιπρόσθετα, η απουσία αρνητικής επίδρασης της ύπαρξης στεαρίνης (μια λιπαρή ύλη με περιεκτικότητα 80% κ.β. σε στεατικό οξύ) στο μέσο της καλλιέργειας, υποδηλώνει ότι η ύπαρξη του διπλού δεσμού στο μόριο του ελαϊκού οξέος εμπλέκεται στον μηχανισμό παρεμπόδισης που ασκεί η παρουσία του μονοακόρεστου λιπαρού οξέος στο βακτήριο C. butyricum. Το δεύτερο στάδιο του πειραματικού σχεδιασμού περιλάμβανε την διερεύνηση της στρατηγικής αναεροβίωσης και της γεωμετρίας του βιοαντιδραστήρα, στην αύξηση του βακτηρίου C. butyricum και την δυνατότητα παραγωγής 1,3-προπανοδιόλης, σε βιοαντιδραστήρες διαλείποντος και ημι-διαλείποντος έργου, συνολικού όγκου 1-, 3- και 4.5-L. Εν προκειμένω, κατά την καλλιέργεια του μικροοργανισμού σε βιοαντιδραστήρα διαλείποντος έργου, με συνεχή εμφύσηση αερίου αζώτου, διαπιστώθηκε η ικανότητα της επιτυχούς τέλεσης της προπανοδιολικής ζύμωσης, ανεξάρτητα από την αρχική συγκέντρωση της ακάθαρτης γλυκερόλης και την γεωμετρία του βιοαντιδραστήρα. Αντιθέτως, κατά την απουσία εμφύσησης αερίου αζώτου (ήτοι υπό συνθήκες «αυτό-παραγόμενης» αναεροβίωσης μέσω των αερίων που παράγονται κατά το μεταβολισμό), σημειώθηκαν αξιόλογες διαφοροποιήσεις στην βιοχημική απόκριση του βακτηρίου. Συγκεκριμένα, σε βιοαντιδραστήρα 1-L, η απουσία της εμφύσησης αερίου αζώτου ευνόησε την σύνθεση γαλακτικού οξέος, μέσω του ενζύμου της γαλακτικής αφυδρογονάσης. Το φαινόμενο αυτό εντοπίστηκε μόνο κατά την τέλεση της βιοδιεργασίας σε βιοαντιδραστήρα μικρού όγκου, οφειλόμενο πιθανότατα στην μερική παρεμπόδιση της φωσφοροκλαστικής αντίδρασης, εξαιτίας της επίτευξης ανεπαρκούς αναερόβιου περιβάλλοντος εντός του βιοαντιδραστήρα. Έτσι, κατά την ημι-συνεχή καλλιέργεια του βακτηρίου C. butyricum υπό συνεχή εμφύσηση αζώτου επετεύχθη μέγιστη παραγωγή 1,3-προπανοδιόλης ίση με 70.8 g/L, ενώ υπό συνθήκες αυτό-παραγόμενης αναεροβίωσης, παρήχθησαν μόνο 30.5 g/L της εν λόγω διόλης. Ως εκ τούτου, από τα ανωτέρω αποτελέσματα τεκμαίρεται ότι ο συνδυασμός της στρατηγικής αναεροβίωσης και της γεωμετρίας του βιοαντιδραστήρα, δύναται να μεταβάλλει την βιοχημική συμπεριφορά του εν λόγω στελέχους. Ιδιαίτερη μνεία δόθηκε στην εύρεση του μέγιστου σημείου ανεκτικότητας του μικροοργανισμού στην παρουσία της 1,3-προπανοδιόλης (παραγόμενης και εξωγενώς προστιθέμενης), αλλά και της επίδρασης που αυτή ασκεί στο προφίλ των κυριότερων λιπαρών οξέων των κυτταρικών λιπιδίων του βακτηρίου. Για τον σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκαν πειράματα σε βιοαντιδραστήρα διαλείποντος έργου, κατά τα οποία προστίθεντο διάφορες συγκεντρώσεις 1,3-προπανοδιόλης στην εκθετική φάση της αύξησης του βακτηρίου C. butyricum. Διαπιστώθηκε η ικανότητα του μικροοργανισμού να ανθίσταται στην ύπαρξη 70 g/L και πλέον βιολογικώς παραχθείσης και εξωγενώς προστιθέμενης 1,3-προπανοδιόλης. Η δυναμική προσαρμογής του μικροοργανισμού σε περιβάλλον με υψηλές συγκεντρώσεις 1,3προπανοδιόλης

αξιολογήθηκε και κατά την αύξηση του σε συνεχή συστήματα καλλιέργειας. Όσον αφορά στην σύσταση των κυτταρικών λιπιδίων του βακτηρίου, διαπιστώθηκε ότι η προσθήκη της εν λόγω διόλης κατά την ασυνεχή καλλιέργεια του μικροοργανισμού ευνόησε την σύνθεση ακόρεστων λιπιδίων. Αντιθέτως, κατά την συνεχή καλλιέργεια του βακτηρίου, η προστιθέμενη 1,3-προπανοδιόλη κατά την κατάσταση δυναμικής ισορροπίας, ευνόησε την βιοσύνθεση κορεσμένων λιπαρών οξέων. Ωστόσο, η επαγόμενη αύξηση του ποσοστού των κορεσμένων λιπαρών οξέων από την προσθήκη της 1,3-προπανοδιόλης, βρέθηκε να αίρεται κατά το μεταβατικό στάδιο της καλλιέργειας και μέχρι την επίτευξη στάσιμου σταδίου, ως αποτέλεσμα της βαθμιαίας απομάκρυνσης της διόλης από τον χημειοστάτη. Εν συνεχεία, ακολούθησε η μελέτη της βιοχημικής απόκρισης του βακτηρίου C. butyricum κατά την συνεχή καλλιέργεια του, υπό διαφορετικούς ρυθμούς αραίωσης και συγκεντρώσεως γλυκερόλης, τόσο σε συνάρτηση με την παραγόμενη 1,3-προπανοδιόλη, όσο και με την μεταβολή της σύστασης των κυτταρικών λιπιδίων του μικροοργανισμού. Αρχικά, ο πειραματικός σχεδιασμός προέβλεπε την εφαρμογή διαφορετικών ρυθμών αραίωσης (D) με σταθερή συγκέντρωση της ακάθαρτης γλυκερόλης στο θρεπτικό μέσο εισόδου της συνεχούς καλλιέργειας, υπό συνθήκες συνεχούς εμφύσησης αζώτου αλλά και αυτό-παραγόμενης αναεροβίωσης. Διαπιστώθηκε ότι η απόδοση του μικροοργανισμού ήταν σαφώς καλύτερη κατά την επίτευξη αναερόβιου περιβάλλοντος με συνεχή παροχή αερίου αζώτου, ενώ κατά την αυτόπαραγόμενη

αναεροβίωση σημειώθηκαν αξιοσημείωτες βιοχημικές μεταβολές, οφειλόμενες ως επί το πλείστον στην αύξηση της συγκέντρωσης του γαλακτικού οξέος. Μάλιστα, στις εν λόγω συνθήκες καλλιέργειας, η παραγωγή του γαλακτικού οξέος βρέθηκε να ευνοείται κατά την εφαρμογή χαμηλών ρυθμών αραίωσης. Επιπρόσθετα, κατά εφαρμογή αυξανόμενων συγκεντρώσεων της ακάθαρτης γλυκερόλης στον χημειοστάτη με ταυτόχρονη διατήρηση σταθερού ρυθμού αραίωσης, ο μικροοργανισμός εμφάνισε ικανοποιητική επίδοση κατά την καλλιέργεια του με αρχική συγκέντρωση γλυκερόλης στο θρεπτικό μέσο εισόδου ίση με 80 g/L. Συγκεκριμένα, κατά την επίτευξη κατάστασης δυναμικής ισορροπίας, εντός του χημειοστάτη βρίσκονταν 31.1 g/L 1,3-προπανοδιόλης, με τον αντίστοιχο συντελεστή απόδοσης να λαμβάνει την τιμή των 0.54 g ανά g καταναλωθέντος υποστρώματος. Επιπροσθέτως, μελετήθηκε η επίδραση των συνθηκών καλλιέργειας (ρυθμός αραίωσης, αρχική συγκέντρωση ακάθαρτης γλυκερόλης και στρατηγική της εφαρμογής αναερόβιου περιβάλλοντος στον βιοαντιδραστήρα) στην σύσταση των κυτταρικών λιπιδίων του μικροοργανισμού. Ως εκ τούτου, παρουσιάστηκαν διαφοροποιήσεις, σχετιζόμενες με την συνεχή εμφύσηση ή μη αερίου αζώτου κατά την διάρκεια της συνεχούς καλλιέργειας του. Ειδικότερα, η ύπαρξη αερίου αζώτου στο περιβάλλον της καλλιέργειας κατέστησε το κλάσμα των κυτταρικών λιπιδίων του μικροοργανισμού πιο κορεσμένο, εν συγκρίσει με την αντίστοιχη κατανομή της σύστασης των λιπιδίων κατά την επίτευξη στάσιμου σταδίου υπό συνθήκες αυτό-παραγόμενης αναεροβίωσης. Ακόμη, διαπιστώθηκε ότι κατά την συνεχή καλλιέργεια του βακτηρίου, η αύξηση της αρχικής συγκέντρωσης της πηγής άνθρακα είχε ως αποτέλεσμα να καταστεί η σύσταση των κυτταρικών λιπιδίων του βακτηρίου σαφώς πιο κορεσμένη. Τέλος, στη παρούσα διατριβή διερευνήθηκε και προτάθηκε η δυνατότητα της διεξαγωγής της προπανοδιολικής ζύμωσης υπό μη στείρες συνθήκες καλλιέργειας, ως μια αξιοποιήσιμη μέθοδος στο εγχείρημα της βιομηχανικής εφαρμογής της εν λόγω βιοδιεργασίας. Για τον σκοπό αυτό αξιολογήθηκε η επίδοση του βακτηρίου C. butyricum σε διάφορα συστήματα καλλιέργειας. Συγκεκριμένα, κατά την καλλιέργεια του μικροοργανισμού σε βιοαντιδραστήρα διαλείποντος έργου, διαπιστώθηκε η επιτυχής ολοκλήρωση της βιοδιεργασίας, τόσο κατά την χρήση διαφόρων ακάθαρτων γλυκερολών ποικίλης σύστασης και προελεύσεως, όσο και κατά την τέλεση της προπανοδιολικής ζύμωσης με αυξανόμενες αρχικές συγκεντρώσεις υποστρώματος. Ιδιαίτερα ικανοποιητική κρίθηκε η επίδοση του μικροοργανισμού κατά την ημι-συνεχή καλλιέργεια του, όπου παρήχθησαν τελικώς 67.9 g/L 1,3-προπανοδιόλης, με τον συντελεστή απόδοσης Υ να λαμβάνει την τιμή 0.55 g/g. Τέλος, η δυνατότητα εφαρμογής της προπανοδιολικής ζύμωσης υπό μη στείρες συνθήκες αξιολογήθηκε κατά την συνεχή καλλιέργεια του μικροοργανισμού, όπου και διαπιστώθηκε η σταθερότητα της βιοδιεργασίας ενώ καθαρότητα της καλλιέργειας επικυρώθηκε με την εφαρμογή της ανάλυσης της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης και της ηλεκτροφόρησης σε διαβαθμισμένο αποδιατακτικό πήκτωμα(PCR-DGGE).

Aim of the present PhD thesis was to investigate the physiological behavior of the bacterial strain C. butyricum VPI 1718 during its growth on crude glycerol-based media. Crude glycerol comprises a renewable carbon source and its production is carried out on international basis as the main by-product of soap and alcohol industries. The recently rapid development of alternative fuel production industries, such as biodiesel and bioethanol, has led into the significant increment of crude glycerol reserves. The latter can be considered as a by-product (or/ and waste) in need for further purification-process. Therefore, in order to ascertain the suitability of crude glycerol as growth substrate for the strain C. butyricum VPI 1718, it was firstly decided to investigate the impact of various impurities which are found in crude glycerol composition upon microbial growth. These impurities corresponded to sodium and potassium phosphate salts (Na 2 HPO 4 , K 2 HPO ), sodium chloride (NaCl), methanol, as well as oleic acid. During growth of the strain in anaerobic static flasks, it was observed that, with the exception of phosphate salts, the presence of sodium chloride at concentration of 4.5% (w/w of glycerol) had an evident inhibitory effect not only in terms of microbial growth, but also in terms of 1,3-propanediol production. However, the realization of the bioprocess in batch bioreactor experiments with increased sodium chloride amounts (up to 30% w/w), did not revealed any signs of growth restriction. Moreover, C. butyricum presented tolerance against various concentrations of methanol during batch bioreactor, as well as continuous cultures where alcohol additions were carried out at steady states. Nevertheless, the existence of oleic acid in the culture medium was found to negatively influence the biochemical response of the strain, while its tolerance threshold against the monounsaturated fatty acid was determined at 1% (w/w). Additionally, the absence of inhibitory effects during stearin presence in the culture medium (a fatty material composed of 80 % w/w in stearic acid), suggested that the presence of the double bond may play a key role in the growth behavior of the bacterial strain C. butyricum. 4 The second step of the experimental planning anticipated the investigation of the impact of anaerobiosis strategy and the bioreactor geometry upon microbial growth and 1,3-propanediol production. Experimental work was carried out in bioreactors varying in total volume (1-, 3- and 4.5-L) during batch and fed-batch cultivation modes. In batch trials with N gas infusion, the 1,3propanediol fermentation was successfully accomplished, regardless of initial glycerol concentration imposed and bioreactor geometry. However, in the absence of N 2 continual infusion (and hence in conditions of “self-generated” anaerobiosis culture environment), significant variations concerning the biochemical response of the strain were observed. Specifically, at 1-L bioreactor, the absence of N2 infusion at high initial glycerol concentration induced lactate dehydrogenase activity and thus lactic acid synthesis, probably due to partial blockage of phosphoroclastic reaction caused by insufficient self-generated anaerobiosis environment. During fed-batch cultivation with continual N infusion, the strain produced 70.8 g/L of 1,3-propanediol, whereas under self-generated anaerobiosis, 1,3-propanediol pathway was evidently restricted, as only 30.5 g/L of 1,3-propanediol were finally produced. Apparently, N 2

infusion strategy paired with bioreactor geometry can alter the biochemical behavior of the particular strain. Special attention was paid to the evaluation of the tolerance threshold of the microorganism, regarding the presence of 1,3-propanediol (exogenous and biologically produced), as well as the effect that the aforementioned diol could have upon the fatty acid profile of cellular lipids of C. butyricum. For this reason, batch bioreactor trial were conducted in which various additions of 1,3-propanediol were performed during exponential growth phase of the microorganism. Indeed, the strain proved capable of withstanding more than 70 g/L of exogenous and biologically produced 1,3-propanediol. The adaptation dynamics of the strain in high diol content media was further validated during continuous cultivation trials. As far as fatty acid composition of cellular lipids is concerned, the experimental procedure revealed that 1,3propanediol additions during batch bioreactor trials favored unsaturated fatty acid synthesis. On the contrary, when the diol in question was added during achieved steady-states of continuous cultures, was found to render the cellular fatty acids more saturated. However, by monitoring of the transitory phases, it was noticed that the gradual diol washout had an evident impact in the fatty acid composition, by reverting them more unsaturated similarly to the composition obtained

at previously obtained steady-states. The next step undertaken involved the study of the biochemical response of the strain C. butyricum VPI 1718 during its cultivation in continuous mode, under different dilution rates (D) and glycerol concentrations, in terms of both 1,3-propanediol production and cellular lipid profile variations. Firstly, a series of continuous cultivations were realized, in which different dilution rates were imposed whereas initial crude glycerol concentration in the inlet medium was maintained constant, while anaerobic cultivation conditions were achieved either by continual N

infusion, or through “self-anaerobiosis” environment. The performance of the microorganism was by far better during anaerobic cultivation with constant N infusion, while in a selfanaerobiosis” environment significant biochemical alterations were observed. In fact, during cultivation in the above-mentioned conditions, the production of lactic acid was favored in culture runs with low dilution rates. Additionally, when increasing concentrations of crude

glycerol were performed at culture runs of constant dilution rate, the microorganism exhibited satisfactory production of 1,3-propanediol. In particular, during runs with crude glycerol inlet concentration of 80 g/L, the effluent 1,3-propanediol concentration was 31.1 g/L, accompanied by a bioconversion yield equal to 0.54 g per g of consumed glycerol. Moreover, insights were given in relation to the effect of cultivation conditions (dilution rate, crude glycerol concentration, aeration strategy) upon cellular lipid composition of the strain C. butyricum VPI 1718. It was observed that the presence of N infusion rendered the cellular lipids more saturated, in comparison to their composition under “self-anaerobiosis” environment conditions. Furthermore, the increment of crude glycerol inlet concentration rendered the fatty acid composition of bacterial cellular lipids by far more saturated. 2 Finally, the present PhD thesis evaluated and proposed the possibility of 1,3-propanediol fermentation application under non-sterile cultivation conditions, as an exploitable aspect in the attempt of an industrial application of the process. For this reason, the performance of the strain C. butyricum was evaluated during its growth at different cultivation modes. Specifically, in batch bioreactor trials, the microorganism was able of to successful 1,3-propanediol fermentation completion, during utilization of glycerol feedstock of various origin and composition, as well as during increasing concentrations of crude glycerol. Of particular importance was the performance of the strain in fed-batch trials, where 67.9 g/L were finally produced with a bioconversion yield of 0.55 g per g of consumed substrate. Last but not least, the potential application of 1,3-propanediol fermentation under non-sterile conditions was validated during continuous cultivation of the microorganism. Indeed, the sustainability of the proposed bioprocess was established through a continuous run of nearly a month, whereas the stability of the process was validated by the elaboration of PCR-DGGE analysis.