Βιοχημικός χαρακτηρισμός των prolyl cis - trans ισομερασών στο Sinorchizobium meliloti

Abstract

Οι Πεπτιδυλ-Προλυλ cis-trans ισομεράσες (PPIases E.C. 5.2.1.8), καταλύουν την ισομερίωση του πεπτιδικού δεσμού μεταξύ μιας προλίνης και ενός οποιουδήποτε προπορευόμενου αμινοξέος. Οι PPIάσες θεωρούνται ένζυμα ζωτικής σημασίας αφού ο κύριος ρόλος που διαδραματίζουν είναι να υποβοηθούν την διαδικασία αναδίπλωσης διαφόρων πρωτεϊνικών μορίων στόχων έτσι ώστε αυτά να αποκτούν την σωστή τριτοταγή και άρα λειτουργική δομή τους.Υπάρχουν τρείς διαφορετικές οικογένειες PPIασών οι οποίες περιλαμβάνουν τις κυκλοφιλίνες(CYP: Cyclophilins), τις FKBPs (FK506 Binding Proteins) και τις παρβουλίνες (Parvulins). Οι αμινοξικές αλληλουχίες των τριών αυτών οικογενειών δεν σχετίζονται μεταξύ τους αφού τα μέλη των οικογενειών αυτών διαφέρουν στην εξειδίκευση ως προς το υπόστρωμα και την ευαισθησία τους σε διαφορετικούς παρεμποδιστικούς παράγοντες. Στόχος της παρούσας μελέτης ήταν ο χαρακτηρισμός αντιπροσώπων της οικογένειας των παρβουλινών στο ριζόβιο Sinorhizobium meliloti. Με βάση την ομολογία με γνώτες και καλά χαρακτηρισμένες παρβουλίνες του βακτηρίου E.coli, εντοπίστηκε ένα γονίδιο που κωδικοποιεί για μια πιθανή παρβουλίνη στο Sinorhizobium meliloti, το Smc02451. Η αντίστοιχη αμινοξική αλληλουχία μελετήθηκε και βρέθηκε ότι η προς μελέτη πρωτεΐνη διαθέτει μια δομική περιοχή PPIάσης(PPi-PPIC). Επίσης η πιθανή αυτή παρβουλίνη διαθέτει ένα πεπτίδιο οδηγό που την τοποθετεί στην εξωτερική μεμβράνη. Παράλληλα έγινε in silico πρόβλεψη της τριτοταγούς δομής της και μέσω εταιρόλογης έκφρασης στην E.coli , μελετήθηκε η ενζυμική δραστικότητα της υπο έρευνας πρωτεΐνης έναντι συνθετικών τετραπεπτιδίων. Τέλος πραγματοποιήθηκε έλεγχος αλληλεπιδράσεων μεταξύ της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης Smc02451 και πρωτεϊνών του περιπλασμικού χώρου του βακτηρίου Sinorhizobium meliloti.

Peptidyl-prolyl Isomerases(PPIases E.C.5.2.1.8) catalyze the cis-trans isomerisation of the peptidyl-prolyl peptide bond in oligopeptides and proteins, a rate limiting step in the process of protein folding that is essential for generating functional proteins. PPIases are subdivided into four different sequence-unrelated families. Parvulins comprise the third family of PPIases, being the only enzymes of this superfamily that seem to be essential for cell survival. One gene in Sinorhizobium meliloti ,Smc02451,was identified encoding for a putative parvulin-type PPIase. The polypeptide encoded from this gene was expressed in E.coli, and the recombinant protein was purified and biochemically characterized. Interactions between the recombinant protein,Smc02451 and periplasmic proteins of S.meliloti have been also investigated.