Μελέτη καθαρισμού και χημική τροποποίηση με πολυαιθυλενογλυκόλη του ενζύμου L-ασπαραγινάση από E. chrysanthemi

Abstract

Το ένζυμο L-ασπαραγινάση (L-ASNase) καταλύει την μετατροπή της L-ασπαραγίνης (L-asparagine) σε L-ασπαραγινικό και αμμωνία. Χρησιμοποιείται ευρέως για την θεραπεία αιμοποιητικών ασθενειών όπως οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία και λεμφωμάτων. Το ένζυμο προέρχεται από κύτταρα βακτηρίων κυρίως από Ε. coli και Εrwinia chrysanthemi. Η χρήση του ενζύμου ως φαρμακευτικό ενέχει προβλήματα τοξικότητας και παρενεργειών στους ασθενείς. Λόγω αυτών των προβλημάτων οι φαρμακευτικές εταιρείες και πληθώρα επιστημόνων ερευνούν μεθόδους τροποποίησης για τη βελτιστοποίηση της δραστικότητας του ως φάρμακο καθώς και μεθόδους καθαρισμού για τη μείωση της τοξικότητας και των παρενεργειών του.

Στην παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε καθαρισμός του ενζύμου L-ASNase από Ε chrysanthemi χρησιμοποιώντας διαφορετικές χρωματογραφικές τεχνικές. Ειδικότερα, εφαρμόστηκε τόσο χρωματογραφία συγγένειας, σε ακινητοποιημένο L-Asp, όσο και χρωματογραφία ανταλλαγής ιόντων με συνδυασμό ανταλλάκτη ανιόντων και κατιόντων. Και οι δύο μέθοδοι έδωσαν ικανοποιητικά αποτελέσματα. Παράλληλα, πραγματοποιήθηκε μελέτη τροποποίησης του ενζύμου με δραστικό παράγωγο πολυαιθύλενο γλυκόλης (Ν-υδροξυ-ηλεκτρικός εστέρας της ηλεκτρικής μεθοξυ-πολυαιθυλενογλυκόλης, mPEG-SNHS) και διερευνήθηκε η επίδραση της τροποποίησης στα καταλυτικά και μοριακά του χαρακτηριστικά.

The enzyme L-asparaginase (L-ASNase, E.C. 3.5.1.1) catalyzes the conversion of L-asparagine to L-aspartate and ammonia. L-asparaginases of Erwinia chrysanthemi and E. coli have been employed for many years as effective drugs in the treatment of acute lymphoblastic leukemia. The main restrictions to the use of L-ASNase as a therapeutic agent include its premature inactivation and rapid clearance, thus necessitating frequent injections to maintain therapeutic levels, and several types of side effects. To date, the most promising approach to extending the half-life and reducing the immunogenicity and antigenicity of therapeutic proteins is to covalently couple them to poly(ethylene glycol) (PEG). In the present work we report the expression of L-asparaginase from Erwinia chrysanthemi in E. coli and the development of an efficient purification protocol. Purification was carried out using affinity chromatography on L-Asp-Sepharose CL6B affinity adsorbent and ion exchange chromatography. The purified enzyme was PEGylated using methoxypolyethylene glycol-succinate N-hydroxysuccinimide ester. The modified form of the enzyme retained most of its original catalytic activity and exhibited higher stability.