Ανοσοεντοπισμός της β-αμυλάσης και προσδιορισμός της ενεργότητας σε αρτίβλαστα κολοκυθιάς που αναπτύχθηκαν στους 8οC και 25οC (Cucurbita pepo L.)

Abstract

Σε αυτή τη μελέτη εξετάστηκε η δραστηριότητα της β-αμυλάσης σε αρτίβλαστα της κολοκυθιάς. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν οι τεχνικές του ανοσοεντοπισμού της πρωτείνης, της ηλεκτροφορητικής συμπεριφοράς του ενζύμου και in vitro δραστηριότητας του τόσο σε φυσιολογικές συνθήκες ανάπτυξης των αρτιβλάστων όσο και σε συνθήκες καταπόνησης χαμηλών θερμοκρασιών. Για τη μελέτη της ηλεκτροφορητικής συμπεριφοράς του ενζύμου, επινοήθηκε μέθοδος εντοπισμού της β-αμυλάσης σε πηκτή πολυακρυλαμίδης η οποία υπερτερεί των υπαρχουσών στο διαχωρισμό και την ευκρίνεια των ηλεκτροφορητικών ζωνών. Στις ρίζες, η β-αμυλάση εντοπίστηκε στην καλύπτρα, στην επιδερμίδα, στη ζώνη επιμήκυνσης, στις καταβολές των πλαγίων ριζών καθώς και στον κεντρικό κύλινδρο. Στα υποκοτύλια, η παρουσία της πρωτείνης ήταν έντονη στις ηθμαγγειώδεις δεσμίδες. Τέλος, στις κοτύλες, παρατηρήθηκε γενικευμένος εντοπισμός της β-αμυλάσης. Το πρότυπο αυτό του εντοπισμού παραπέμπει όντως στη συμμετοχή της β-αμυλάσης στην υδρόλυση συστατικών του αμύλου για την παραγωγή ενέργειας και σκελετών άνθρακα στα αναπτυσσόμενα φυτικά κύτταρα. Η ηλεκτροφορητική συμπεριφορά του ενζύμου κατέδειξε την ύπαρξη πολλαπλών ηλεκτροφορητικών ζωνών που πιθανόν να σημαίνει ύπαρξη πολλών ισοτύπων του ενζύμου. Τέλος, σε συνθήκες ψυχρού χειρισμού των αρτιβλάστων στους 8οC, η in vitro δραστηριότητα της β-αμυλάσης στα εκχυλίσματα των ριζών, των κοτυλών καθώς και των υποκοτυλίων αυξήθηκε από την πρώτη ημέρα του χεισρισμού και παρέμεινε υψηλή καθόλη τη διάρκεια του πειράματος. Το γεγονός αυτό αν συσχετιστεί και με την ύπαρξη μιας επιπλέον ταινίας στα ηλεκτροφορήματα καταπονημένων φυτών μας οδηγεί στο συμπέρασμα ότι σε συνθήκες χαμηλών θερμοκρασιών παρατηρείται μεγαλύτερη ενεργότητα της β-αμυλάσης που πιθανόν συμβάλλει στην προστασία του φυτού κάτω από αυτές τις συνθήκες.

In the present study the activity of β-amylase in cucumber seedlings was studied. For this purpose, the techniques of immunolocalization, native protein electophoresis as well as the measurement of in vitro activity of extracts from plantlets grown normally or subjected to low temperature stress were employed. A new method was invented which produces better resolution and sharper electrophoretic bands in native protein electrophoresis of the enzyme. In roots, beta amylase was localized mainly in the cap, epidermis, in the elongation zone, in the root primordia and central cylinder. In hypocotyls, β-amylase was localized mainly in the vascular bundles. In cotyledons, the localization signal was distributed throughout the organ. This pattern of localization points to the active involvement of beta amylase in starch constituents’ degradation for energy production and provision of carbon chains for growing plant cells. The native protein electrophoresis showed that the enzyme appears with multiple electrophoretic bands. Finally, under low temperature stress conditions, the in vitro activity of β-amylase in root, hypocotyl and cotyledon extracts was higher after the first day in 8oC and remained high throughout the experiment. These data taken in combination with the appearance of a new electrophoretic band in stress organ extracts, mean that the higher β-amylase activity could participate in the alleviation of seedling stress.