Οι τρανσφεράσες της γλουταθείονης (GSTs) είναι ένζυμα που συνήθως δρουν ως διμερή και καταλύουν τη σύζευξη του τριπεπτιδίου γλουταθειόνη (GSH) με έναν αριθμό ηλεκτρονιόφιλων, λιπόφιλων ουσιών δημιουργώντας ένα υδατοδιαλυτό προϊόν, μειωμένης τοξικότητας. Αυτή η αντίδραση έχει αποδειχθεί πως παίζει σημαντικό ρόλο στην αποδόμηση πολλών τοξικών μορίων, συμπεριλαμβανομένων καρκινογόνων και ζιζανιοκτόνων-εντομοκτόνων, σε ένα μεγάλο εύρος οργανισμών, από θηλαστικά και έντομα έως φυτά. Ένας αριθμός GSTs παίζουν ρόλο στην εξουδετέρωση οξειδωτικών καταπονήσεων μέσω μίας επιπλέον δράσης των ενζύμων ως υπεροξειδάσες της γλουταθειόνης, ενώ πλέον των καταλυτικών ιδιοτήτων τους, συγκεκριμένες GSTs ενεργούν και ως πρωτεΐνες-μεταφορείς για τη μεταφορά υδρόφοβων μορίων εντός του κυττάρου.
Ο στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής αφορά κυρίως στη μελέτη του αποτοξινωτικού ρόλου ενζύμων GSTs ο οποίος βασίζεται στην κατάλυση αντιδράσεων σύζευξης με τοξικές ενώσεις και η ανάλυση της συμπεριφοράς φυτικών και βακτηριακών GSTs. Κατά την αρχική μελέτη βακτηριακών ισοενζύμων GSTs, πραγματοποιήθηκε μελέτη του γονιδιώματος του βακτηριακού στελέχους Agrobacterium tumefaciens C58 και εύρεση αλληλουχιών στη βάση δεδομένων που αντιστοιχούν σε πιθανές GSTs. Σχεδιάστηκαν οι κατάλληλοι εκκινητές για συνολικά 8 ισοένζυμα (AtuGSTl, AtuGST2, AtuGST3, AtuGST4, AtuGST5, AtuGST6, AtuGST7 και AtuGST8) και ακολούθησε απομόνωση γενωματικού DNA από το βακτηριακό στέλεχος Agrobacterium tumefaciens C58. Με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης ενισχύθηκαν και απομονώθηκαν τα γονίδια και ακολούθως αλληλουχήθηκαν και κλωνοποιήθηκαν σε πλασμιδιακούς φορείς έκφρασης της E. coli.
Τα ισοένζυμα που απομονώθηκαν και κλωνοποιήθηκαν από το βακτηριακό στέλεχος Agrobacterium tumefaciens C58 εκφράστηκαν ετερόλογα σε κύτταρα E. coli BL21 (DE3). Η σύκριση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας των ενζύμων επέτρεψε τη φυλογενετική μελέτη τους και τον προσδιορισμό της εξελικτικής σχέσης τόσο μεταξύ τους όσο και με GSTs από άλλους οργανισμούς. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε μελέτη της ενζυμικής τους δραστικότητας έναντι μεγάλου εύρους αλογονωμένων αρωματικών υποστρωμάτων [1-χλωρο-2,4-δινιτροβενζόλιο (CDNB), 1-βρωμο-2,4-δινιτροβενζόλιο (BDNB), 1-φθορο-2,4-δινιτροβενζόλιο (FDNB), 1-ιωδο-2,4-δινιτροβενζόλιο (IDNB) και π-νιτροβενζυλ-χλωρίδιο (pNBC)]. Η οικογένεια ενζύμων AtuGSTs μελετήθηκε επίσης και ως προς τη δραστικότητα υπεροξειδάσης εξαρτώμενης από τη γλουταθειόνη (GPOX) χρησιμοποιώντας ως υποστρώματα το υδροϋπεροξείδιο του κουμενίου (CuOOH) και το tert-βουτυλο-υδροϋπεροξείδιο (tert-BuOOH). Η αντίδραση αναγωγής του διυδροασκορβικού (DHA) σε ασκορβικό οξύ χρησιμοποιώντας GSH, αποκάλυψε ποια ένζυμα εμφανίζουν δραστικότητα ρεδουκτάσης του διυδροασκορβικού οξέος (DHAR) ενώ η δραστικότητα θειολτρανσφεράσης ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας τη 2,2-διθειοδιαιθανόλη (HED) ως υπόστρωμα. Το ζιζανιοκτόνο fluorodifen (διφαινυλαιθέρας), η βρωμοσουλφοφθαλεϊνη και το nitrobenzofurazan μελετήθηκαν επίσης ως πιθανά υποστρώματα των AtuGSTs. Τα υποστρώματα εθακρυνικό οξύ, ^^-4-φαινυλβουτ-3-εν-2-όνη και trans-2-ενενάλη θεωρείται ότι σχηματίζουν συζευγμένα με τη GSH προϊόντα μέσω αντίδρασης προσθήκης Michael στο α,β-ακόρεστο καρβονυλικό τμήμα του μορίου και μελετήθηκαν και στην περίπτωση των ισοενζύμων από το Ag. tumefaciens C58. Τέλος, οι AtuGSTs ελέγχθηκαν επίσης για πιθανή δραστικότητα εστεράσης χρησιμοποιώντας την οξική ρ-νιτροφαινόλη (p-NPA) ως πρότυπο υπόστρωμα, ενώ προκειμένου να εξεταστεί αν καταλύουν αποτελεσματικά την προσθήκη της σουλφυδρυλομάδας της GSH στο ηλεκτρονιόφιλο κεντρικό άτομο άνθρακα των ισοθειοκυανικών ενώσεων χρησιμοποιήθηκαν ως υποστρώματα ο φαινυλαιθυλ-εστέρας και ο ισοθειοκυανικός αλλυλ-εστέρας.
Από το σύνολο των 8 ισοενζύμων που μελετήθηκαν, επιλέχθηκε το ισοένζυμο AtuGST4, το οποίο παρουσίασε αξιοσημείωτα κινητικά χαρακτηριστικά προκειμένου να πραγματοποιηθεί περαιτέρω κινητική και δομική μελέτη του ενζύμου. Το ισοένζυμο AtuGST4 εκφράστηκε ετερόλογα σε κύτταρα E. coli BL21 (DE3). Ο καθαρισμός του ενζύμου πραγματοποιήθηκε με χρωματογραφία συγγένειας σε προσροφητή Ni-NTA-Sepharose με απόδοση και καθαρότητα που έφτανε >98%. Πραγματοποιήθηκαν πειράματα επίδρασης διάφορων παραγόντων στην ταχύτητα της ενζυμικής αντίδρασης όπως του pH και της θερμοκρασίας. Το άριστο pH δράσης που εμφανίζει το ένζυμο είναι κοντά στην περιοχή του 8 ενώ για δυο διαφορετικές τιμές pH 7.6, 7.9, οι τιμές Tm που προέκυψαν είναι 59,95±0,93 °C και 63,33±1,12 °C αντίστοιχα. Λαμβάνοντας υπόψη ότι το άριστο pH δράσης που εμφανίζει το ένζυμο είναι κοντά στην περιοχή του 8, επιλέχθηκε ένα εύρος τιμών pH από 6 έως 8,3 προκειμένου να εξεταστεί η κινητική συμπεριφορά του ένζυμου έναντι του υποστρώματος CDNB. Οι τιμές pH 7.6 και 7.9 παρουσίασαν τις υψηλότερες τιμές σταθερών εξειδίκευσης (kcat/Km) ενώ για την τιμή pH 7.6 παρατηρήθηκε και η χαμηλότερη Km. Πραγματοποιήθηκε επίσης κινητική μελέτη του ένζυμου για τα υποστρώματα fluorodifen, CuOOH, tert-BuOOH και HED. Οι τιμές σταθερών εξειδίκευσης (kcat/Km) εμφανίζονται σημαντικά υψηλότερες για τα υπεροξείδια CuOOH και tert-BuOOH σε σχέση με τα υπόλοιπα υπό μελέτη υποστρώματα. Επιπρόσθετα, ερευνήθηκε η δομική του σταθερότητα υπό την επίδραση γλουταθειόνης και γλυκερόλης. Η τρισδιάστατη δομή του ενζύμου AtuGST4 προσδιορίσθηκε με κρυσταλλογραφία ακτίνων-Χ σε σύμπλοκο με τον αναστολέα νιτροβενζυλ-γλουταθείο (πραγματοποιήθηκε σε συνεργασία με την ομάδα του Δρ. Α. Παπαγεωργίου, Τούρκου, Φιλανδία). Η δομή του ενζύμου επιλύθηκε και πραγματοποιήθηκε στη συνέχεια περιγραφή και ανάλυση των χαρακτηριστικών της δομής, των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των δομικών περιοχών και των υπομονάδων καθώς και των περιοχών δέσμευσης της γλουταθειόνης και των ξενοβιοτικών ενώσεων. Η ανάλυση της δομής του ενζύμου υπέδειξε τρία αμινοξικά κατάλοιπα που αποτέλεσαν στόχο κατευθυνόμενης μεταλλαξιγένεσης με σκοπό να προσδιοριστεί ο τρόπος αλληλεπίδρασης τους με το ενεργό κέντρο της πρωτεΐνης και κατά συνέπεια ο τρόπος με τον οποίο συμμετέχουν στην καταλυτική διαδικασία. Ειδικότερα, με τη μέθοδο quick change PCR προκληθήκαν σημειακές μεταλλάξεις στα αμινοξικά κατάλοιπα Phe22 και Ser25 τα οποία μετατραπήκαν σε Ala. Για τη μετάλλαξη του Α^187σε Ala εφαρμόσθηκε η μέθοδος επικαλυπτόμενης επιμήκυνσης Προκειμένου να αποσαφηνιστεί ο ρόλος των τριών αμινοξικών καταλοίπων (Phe22, Ser25 και Arg187) στην κατάλυση, οι μεταλλαγμένες μορφές καθαρίστηκαν, μελετήθηκε η ενζυμική τους δραστικότητα έναντι μιας σειράς υποστρωμάτων και μελετήθηκε η κινητική τους συμπεριφορά. Τέλος, ερευνήθηκε η επίδραση του ιξώδους στις κινητικές σταθερές των μεταλλαγμένων μορφών με σκοπό να βρεθεί το καθοριστικό στάδιο της καταλυτικής αντίδρασης του ενζύμου AtuGST4.
Η κρυσταλλική δομή του AtuGST4 προσδιορίστηκε με ανάλυση σε 1.4 Α. Παρόλο που το ένζυμο AtuGST4 υιοθετεί την κανονική GST αναδίπλωση, αναγνωρίστηκαν ξεχωριστά χαρακτηριστικά στη δομή και την αλληλουχία της πρωτεΐνης που τη διαφοροποιούν από τις υπόλοιπες ήδη χαρακτηρισμένες GSTs. Η απουσία των κλασσικών, καταλυτικά απαραίτητων αμινοξικών καταλοίπων (Tyr, Ser, Cys) αποτελεί στοιχείο που διακρίνει την AtuGST4 από όλες τις άλλες κυτταροπλασματικές GSTs ταυτοποιημένης δομής και λειτουργίας. Ένα αμινοξικό κατάλοιπο Arg (Arg34), ένα κατανεμημένο δίκτυο ηλεκτρονίων και μια γέφυρα ενός δικτύου μορίων νερού πιθανότατα αποτελούν τη βάση του καταλυτικού μηχανισμού του ενζύμου. Η συγκριτική ανάλυση της πρωτεϊνικής αλληλουχίας, οι δομικές πληροφορίες και η κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση σε συνδυασμό με τις κινητικές μελέτες που πραγματοποιήθηκαν, έδειξαν ότι τα κατάλοιπα Phe22, Ser25, και Arg187 αποτελούν επιπρόσθετα σημαντικά δομικά στοιχεία τα οποία διαμορφώνουν την καταλυτική αποτελεσματικότητα και εξειδίκευση του ενζύμου. Η ευρεία καταλυτική λειτουργική ικανότητα του ενζύμου σε συνδυασμό με την περιορισμένη κατανομή ομόλογων GSTs σε βακτήρια εδάφους, ίσως υπαγορεύουν έναν συγκεκριμένο λειτουργικό ρόλο για το ένζυμο AtuGST4 ανάμεσα στα βακτήρια που διαβιούν στο έδαφος. Όσον αναφορά τη μελέτη φυτικών ισοενζύμων GSTs, αυτή αρχικά περιλαμβάνει κλωνοποίηση δυο ενζύμων (GmGSTU2-2 και GmGSTU10-10) από σόγια (Glycine max) που ανήκουν στην οικογένεια τ (tau) των GSTs. Συγκεκριμένα, με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης ενισχύθηκαν και απομονώθηκαν τα γονίδια και ακολούθως αλληλουχήθηκαν και κλωνοποιήθηκαν σε πλασμιδιακούς φορείς έκφρασης της E. coli. Τα ισοένζυμα GmGSTU2-2 και GmGSTU10-10 από Glycine max εκφράστηκαν ετερόλογα σε κύτταρα E. coli BL21 (DE3) και πραγματοποιήθηκε καθαρισμός των συγκεκριμένων κλώνων (καθαρότητα >98%) με χρωματογραφία συγγένειας με προσροφητή που φέρει ακινητοποιημένη γλουταθειόνη σε αγαρόζη (BES-GSH). Τα καθαρά ένζυμα χρησιμοποιήθηκαν για να ελεγχθεί η ενζυμική τους δραστικότητα έναντι μιας σειράς πιθανών υποστρωμάτων. Οι χημικές ουσίες οι οποίες μελετήθηκαν ως πιθανά υποστρώματα περιλαμβάνουν αλογονομένα παράγωγα, υπεροξείδια, ακόρεστες αρωματικές ενώσεις και ισοθειοκυανικά παράγωγα. Ακολούθησε κινητική ανάλυση των ενζύμων ως προς τη γλουταθειόνη και τα υποστρώματα: 1-χλωρο-2,4-δινιτροβενζόλιο (CDNB), fluorodifen, υδροϋπεροξείδιο του κουμενίου και tert-βουτυλ-υδροϋπεροξείδιο. Παρατηρήθηκε ότι για μεταβαλλόμενες συγκεντρώσεις του υποστρώματος CDNB, το ένζυμο GmGSTU10-10 εμφανίζει σχεδόν τριπλάσια Km σε σχέση με το GmGSTU2-2. Τα δυο ένζυμα εμφάνισαν παρόμοια κινητική συμπεριφορά όταν χρησιμοποιηθήκαν ως μεταβαλλόμενα υποστρώματα τα fluorodifen και GSH. Από τη μελέτη του καθοριστικού σταδίου της καταλυτικής αντίδρασης για το υπόστρωμα CDNB διαπιστώθηκε ότι για το ένζυμο GmGSTU10-10 φαίνεται πως το καθοριστικό στάδιο της αντίδρασης σχετίζεται με την απελευθέρωση του προϊόντος της αντίδρασης, ενώ για το ένζυμο GmGSTU2-2 το καθοριστικό στάδιο συνδέεται με τη χημεία της αντίδρασης ή με κάποια μη ελεγχόμενη από τη διάχυση δομική ανακατάταξη της πρωτεΐνης. Επιπρόσθετα, εξετάστηκε η επίδραση της θερμοκρασίας στη σταθερότητα του ενζύμου (Tm=60,95±1,03 °C και Tm=62,43±0,62 °C για τα ένζυμα GmGSTU2-2 και GmGSTU10-10 αντίστοιχα) και προσδιορίστηκαν οι θερμοδυναμικές σταθερές της καταλυτικής αντίδρασης (Εα, ΔΚ^, ΔS). Επίσης, πραγματοποιήθηκαν πειράματα για την επίδραση του pH στην ταχύτητα της ενζυμικής αντίδρασης από τα οποία προέκυψε ότι οι άριστες τιμές pH, και για τα δυο ένζυμα κυμαίνονται στη βέλτιστη περιοχή pH των ενζύμων GSTs. Στο πλαίσιο της κινητικής μελέτης των δύο ενζύμων, ελέγχθηκε η αναστολή της ενζυμικής δραστικότητας από ξενοβιοτικές ενώσεις, ζιζανιοκτόνα και εντομοκτόνα (atrazin, permethrin, α-cypermethrin, β-cypermethrin, alachlor, carbaryl, diazinon, malathion, metalochlor, DDT, diuron, fenvalerate, λ-cyhalothrin, dieldrin, aldrin, endosulfan και propoxur) και προσδιορίστηκαν οι τιμές IC50 (ανασταλτική συγκέντρωση) με τους αναστολείς alachlor, fenvalerate, spirodichlofen και λ-cyhalothrin.
Glutathione transferases (GSTs) are enzymes that normally act as dimeric proteins and
catalyze the conjugation of the tripeptide glutathione (GSH) with a number of electrophilic,
lipophilic substances, creating a water-soluble product, with reduced toxicity. This reaction
has been shown to play an important role in the degradation of many toxic molecules,
including carcinogens, pesticides and herbicides in a wide range of organisms, from insects to
mammals and plants. A number of GSTs play a role in the suppression of oxidative stress
through an additional action of these enzymes as glutathione peroxidases, while beyond their
catalytic properties, certain GSTs act as carrier proteins for the transport of hydrophobic
molecules within the cell.
Τhe overall objective of the present thesis is the study the detoxification role of GSTs
enzymes isolated from plants and bacteria. Concerning the bacterial GSTs isoenzymes, the
study was focused on the genome of Agrobacterium tumefaciens C58. A genome survey
revealed the presence of eight GST-like proteins in A. tumefaciens C58 (AtuGSTs).
Comparison by multiple sequence alignment generated a dendrogram revealing the
phylogenetic relationships of AtuGSTs-like proteins. The beta and theta classes identified in
other bacterial species are represented by five members in A. tumefaciens C58. In addition,
there are three “orphan” sequences that do not fit into any previously recognized GST classes.
The eight GST-like genes were cloned, expressed in E. coli and their substrate specificity was
determined towards eighteen different substrates. The substrate specificity of the AtuGST
family members was investigated in order to identify catalytic activities that may be related to
their biological function. The assays included tests of thioether and thioester formation, i.e.
nucleophilic attack at carbon as well as at electrophilic sulfur with an organic thiocyanate as
substrate. In addition, the AtuGSTs were also examined whether they exhibit peroxidase,
dehydroascorbate reductase or thioltransferase activity. The results showed that AtuGSTs
catalyze a broad range of reactions, with different members of the family exhibiting quite
varied substrate specificity.
A GST-like sequence from A. tumefaciens C58 (AtuGST4) with low similarity to other
characterized GST family of enzymes was identified. Phylogenetic analysis showed that it
belongs to a distinct from previously described GST classes. In order to characterize the
AtuGST4 protein, the full-length sequence was cloned and expressed in E. coli BL21 (DE3).
The expressed protein was tested for its ability to catalyze GSH/CDNB conjugation reaction.
SDS-PAGE analysis of crude lysates showed that the recombinant enzyme was expressed at
high levels as a soluble protein in E. coli. The enzyme did not bind adequately to the classical
ABSTRACT
xxiii
affinity adsorbents (GSH-Sepharose or hexyl-GSH-Sepharose) that are widely used for the
purification of recombinant as well as native GSTs. This indicates differences in G-site
topology of AtuGST4 compared to the majority of other GST classes that are efficiently
purified using GSH-based affinity adsorbents. AtuGST4 was purified (>98% purity) in a
single-step procedure by metal-chelate affinity chromatography on Ni-NTA affinity
adsorbent, suggesting that the enzyme may exhibits metal binding properties.
Functional analysis showed that AtuGST4 exhibits significant transferase activities against the
common substrates aryl halides, as well as very high peroxidation activity towards organic
hydroperoxides. More specifiacally, regarding the several halogenated aromatic compounds
that were tested, CDNB (and its analogues BDNB, FDNB, IDNB), and p-nitrobenzyl chloride
were accepted substrates for the enzyme, although significant differences in specific activity
were observed. The enzyme’s specific activity for the 2,4-dinitrobenzyl halides decrease in
the order of F>I > Br > Cl. Steady-state kinetic analysis using CDNB and GSH was carried
out and the kcat, and Km parameters were determined. The Km values for GSH and CDNB
were determined as 0,29 mM and 1,5 mM, respectively.
We have shown that AtuGST4 exhibits high GSH-dependent peroxidase activity (GPOX)
towards organic hydroperoxides such as cumene hydroperoxide and tert-butyl hydroperoxide.
The specific activity with cumene hydroperoxide is 23,6 U/mg which is higher than that
exhibited by other GST isoenzymes. With cumene hydroperoxide and tert-butyl peroxide as
electrophile substrates, AtuGST4 exhibits low Km values with high catalytic efficiency
(kcat/Km). These findings suggest that hydroperoxides may be the ‘natural’ substrates for
AtuGST4. AtuGST4 does not conjugate efficient ethacrynic acid and the alkenals trans-4-
phenyl-3-buten-2-one and nonenal. These substrates are thought to form conjugates with GSH
via Michael addition reaction to the α,β-unsaturated ketone moiety. In addition, the enzyme
does not conjugate efficiently the thiol group of GSH to the electrophilic central carbon of the
isothiocyanate group using allyl isothiocyanate and phenethyl isothiocyanate as substrates.
AtuGST4 showed dehydroascorbate reductase (DHAR) activity catalyzing the reduction of
dehydroascorbate (DHA) to ascorbic acid in the presence of GSH. In addition, the enzyme
exhibited thioltransferase activity using the 2-hydroxyethyl disulfide (HED) as a substrate.
The kcat and Km values for HED were determined as 2.43 min-1 and 4.12 mM, respectively.
GSTs have a well-characterized role in determining the metabolism and selectivity of
diphenylether herbicides such as fluorodifen. Fluorodifen is a photobleaching diphenylether
herbicide that GSTs catalyze its conjugation with the GSH to form non-toxic Sglutathionylated
products. AtuGST4exhibits relative moderate activity towards fluorodifen
xxiv
and the Km values for GSH and flurodifen were determined as 1.5 mM and 77.03 mM,
respectively.
The crystal structure of AtuGST4 has been determined at 1.4 Å resolution in complex with S-
(p-nitrobenzyl)-glutathione (Nb-GSH). Although AtuGST4 adopts the canonical GST fold we
identified sequence and structural characteristics distinct from previously characterized GSTs.
The absence of the classic catalytic essential residues (Tyr, Ser, Cys) distinguishes
AtuGST4from all other cytosolic GSTs of known structure and function. An Arg residue
(Arg34), an electron-sharing network and a bridge of a network of water molecules may form
the basis of catalytic mechanism. Comparative sequence analysis, structural information and
site-directed mutagenesis in combination with kinetic analysis showed that Phe22, Ser25, and
Arg187 are important structural moieties that modulate the enzyme’s catalytic efficiency and
specificity. The wide catalytic function of this enzyme together with the restricted distribution
of this class to soil bacteria may indicate a specific functional role for this enzyme in soil
bacteria.
Regarding the study of plant GST isoenzymes, two GST genes from Glycine max were cloned
and expressed in E. coli. The expressed proteins (GmGSTU2-2 and GmGSTU10-10) were
efficiently purified (>98% purity) using GSH–agarose affinity chromatography adsorbents.
Enzyme activities were measured for 1-halogen-2,4-dinitrobenzole derivatives (CDNB,
FDNB, BDNB, IDNB), fluorodifen, ethacrynic acid, 4-nitrobenzylchloride (NBC),
bromosulfophthalein and trans-4-phenyl-3-buten-2-one. Other substrates used were cumene
hydroperoxide (CuOOH), tert-butyl hydroperoxide, 4-chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole
(NBD-Cl), trans-2-nonenal, phenethyl isothiocyanate and allyl isothiocyanate.
Dehydroascorbate reductase activity using dehydroascorbate (DHAR) as substrate and
thioltransferase activity using the 2-hydroxyethyl disulfide (HED) as a substrate were also
determined. A study for the inhibition of GST activity of GmGST2-2 and GmGST210-10 was
also carried out using a large number of herbicides atrazine, diuron, alachlor, metolachlor and
insecticides such us fenvalerate, permethrin, diazinon, malathion, carbaryl, α-cypermethrin, β-
cypermethrin, λ-cyhalothrin, dieldrin, aldrin, DDT, endosulfan, propoxur. The results showed
that both enzymes are sensitive to selected compounds such as permethrin, fenvalerate, λ-
cyhalothrin, spirodiclofen, DDT and alachlor.
As mentioned above, glutathione transferases (GSTs; EC 2.5.1.18) form a group of
multifunctional enzymes catalyzing the conjugation of a broad range of toxicologically
important halogenated compounds to the tripeptide glutathione (GSH) with concomitant
xxv
halogen ion release. Another important goal of the present thesis was to develop a rapid and
reliable method of screening of GST isoenzymes and mutant libraries. A rapid quantitative
screening method for GSTs based on colorimetric measurement of halogen ions released from
halogenated xenobiotics was developed. The assay is based on the color formation resulting
from the reaction of Hg(SCN)2 with the released halogen ion of the substrate in the presence
of Fe3+. The color intensity is proportional to the extent of the catalytic reaction, allowing a
quantitative measurement of the GST catalytic activity. The assay was performed using crude
recombinant Escherichia coli cell lysates from the isoenzyme GmGSTU4-4 from Glycine max
in 96-well microtiter plates. The suitability of the colorimetric assay for screening mutant
GST variants derived from a directed evolution library was successfully evaluated. In
addition, the assay was also used for screening synthetic inhibitors. It was concluded that the
proposed colorimetric assay is selective and sensitive and allows the screening of large
numbers of samples within a few minutes. The ultimate goal is the application of this method
in order to evaluate the biodegradative ability of GSTs to transform halogenated toxic
environmental pollutants into non-toxic products.
