Η παρούσα διατριβή αποδεικνύει ότι το πυρηνικό γονίδιο AtLOn1 περιέχει δύο ενάρξεις της μετάφρασης στο ίδιο αναγνωστικό πλαίσιο κωδικοποιώντας για δύο ισόμορφα. Το πλασιδιακό ισόμορφο Lon1L που ξεκινά στην πρώτη Μεθειονίνη και το μιτοχονδριακό ισόμορφο Lon1S το οποίο ξεκινά στη Μεθειονίνη 46. In vivo μικροσκοπία φθορισμού του AtLon1 γονιδίου σε σύντηξη με το YFP έδειξε ότι συμβαίνει ολίσθηση του μηχανισμού σάρωσης του ριβοσώματος στην περιοχή του πρώτου AUG, οδηγώντας σε εναλλακτική έναρξη της μετάφρασης στο δεύτερο κωδικόνιο έναρξης. Επίσης παρουσιάζεται ρύθμιση και σε μεταγραφικό επίπεδο αφού υπάρχει και εναλλακτική έναρξη της μεταγραφής σε συνδυασμό με την ανάπτυξη ή περιβαλλοντικές συνθήκες. Το γονίδιο AtLon1 επιτυχώς συμπλήρωσε το φαινότυπο του μεταλλάγματος Pim1 στη ζύμη ανεξάρτητα του πεπτιδίου οδηγού. Ακόμη, το πεπτίδιο οδηγός του AtLon1 είναι αρκετα συντηρημένο και σε άλλους φυτικούς οργανισμούς.
Οι πρωτεΐνες που περιέχουν το τμήμα PORR (Plant Organelle RNA Recognition) εμπλέκονται στο μάτισμα των πλαστιδιακών γονιδίων της ομάδας ΙΙ. Το γονίδιο Leukothea1 περιέχει το τμήμα PORR και είναι αναγκαίο την ανάπτυξη του εμβρύου. Το μετάλλαγμα leuko1-1 εμφανίζει λευκές κοτυληδόνες, ενώ η ολική έλλειψη της πρωτεΐνης οδηγεί στη θνησιμότητα του εμβρύου, όπως εμφανίζεται στο μετάλλαγμα leuko1-2. Η πρωτεΐνη Leuko1 έχει πεπτίδιο οδηγό για τον χλωροπλάστη, αλλά και σινιάλα εισόδου και εξόδου από τον πυρήνα, τα NLS και NES αντίστοιχα. Μικροσκοπική ανάλυση των κατασκευών του γονιδίου με YFP έδειξε ότι η πρωτεΐνη μπορεί να τοποθετείται στον πυρήνα, αλλά και στον χλωροπλάστη και μάλιστα διακινούμενη από τον πυρήνα στον χλωροπλάστη. Ο φαινότυπος του μεταλλάγματος leuko1-1 οφείλεται στην έλλειψη της πρωτεΐνης από τον πυρήνα. Για αυτό το λόγο, η αποκλειστική τοποθέτηση της πρωτεΐνης Leuko1 στον πυρήνα συμπλήρωσε το φαινότυπο του μεταλλάγματος leuko1-1.
Η παρούσα διατριβή παρέχει πληροφορίες και αποτελέσματα που έχουν να κάνουν με τους μηχανισμούς τοποθέτησης και λειτουργίας των γονιδίων Lon1 και Leukothea αναφορικά της ανάπτυξης του φυτικού σώματος. Η πολλαπλή επανοτοποθέτηση των παραπάνω πρωτεϊνών παρέχει ένα εξελιγμένο δίκτυο σηματοδότησης μέσα στο φυτό έναnτι της ανάπτυξη ή και των περιβαλλοντικών συνθηκών που επικρατούν.
Cellular homeostasis and survival relies on components of protein quality control mechanism including chaperones for proper folding of non-native polypeptides and proteases to eliminate the irreparably damaged proteins. In bacteria and eukaryotic organelles the ATP-dependent Lon protease plays a critical role in the removal of oxidised proteins and hence prevents cumulative damage by deleterious degradation-resistant aggregates. This report demonstrates that nuclear AtLon1 gene contains two in-frame translation initiation codons encoding for a long plastidial isoform (Lon1L) starting at Met1 and a short mitochondrial targeted isoform (Lon1S) starting at Met46. In vivo fluorescence microscopy of AtLon1 N-terminal deletion variants fused to YFP revealed leaky ribosome scanning around the first AUG, which deviates extensively from the optimum Kozak consensus, leading to alternative translation initiation at the second initiation codon. Additional complexity results from differential selection of transcription start sites (TSS) depending on tissue specificity and stress-response. The TSS for Lon1S devoid of the first AUG context is predominant, whereas the upstream TSS containing the two in-frame AUGs is highly expressed only in leaves and under shortage of light. The twin N-terminal presequences of AtLon1 are highly conserved among various plant species. Interestingly, AtLon1 successfully complemented the mitochondrial mutant phenotype of the yeast PIM1 gene homolog through an AUG context-dependent but N-terminal targeting domain independent mechanism. In line with the widely-held theory that dual-targeted condition is a gain-of-function derived from gene duplication, the AtLon1 twin presequences may represent an intermediate in the evolution of dual-targeting affecting post-germinative growth.
Recent studies have shown that proteins containing the PORR (Plant Organelle RNA Recognition) domain are implicated in group II intron splicing mechanism of chloroplast encoded genes. Leukothea1 gene that contains the PORR domain is necessary for embryo development. The leuko1-1 mutant allele caused by single nucleotide change of G to A resulting in amino acid substitution of Glycine 373 to Aspartic acid. The leuko1-1 seedlings have typical white-cotyledon phenotype. The total loss of Leukothea1 function in leuko1-2 mutant alleles results in embryo arrest upon transition from the globular to the heart-stage embryo. In silico analysis has shown that Leuko1 protein has a putative transit peptide for chloroplast targeting and signals for nuclear localization NLS and export NES. Microscopic analysis of Leuko1 gene constructs fused to YFP confirmed the dual targeting properties of Leuko1 to both chloroplasts and the nucleus. Furthermore, the Leuko1 roadmap to the nucleus and back to the cytoplasm from the nucleus depends on the Importin1α and Exportin1 mechanisms, respectively. The leuko1-1 phenotype results from the disturbed equilibrium of the protein in the nucleus due to enhanced protein export. Therefore, the truncated version of Leuko1 protein missing the transit peptide at the N-terminus complements the leuko1-1 phenotype, highlighting the crucial role of Leuko1 in the nucleus. Leuko1 protein targeting to the nucleus is associated with the mRNA processing and splicing of nuclear-encoded genes targeted to the chloroplasts.
This study provides information regarding the mechanisms of two nuclear-encoded proteins translocation to distinct subcellular compartments. Plant organelles originate for endosymbiosys of bacteria in the primitive eukaryotic cell. During the course of evolution organellar targeting proteins encoded by the nuclear genome involved in fundamental biological processes including mRNA processing/splicing (Leukothea1) or protein processing (Lon1) mechanisms, attained dual-targeting properties. These features for multi sub-cellular localization provide a sophisticated network for plant signaling response to environmental or developmental cues.
