Βιοχημική και μοριακή ανάλυση της β-τύπου αφυδάτασης των δισανθρακικών του Azotobacter vinelandii

Abstract

Οι αφυδατάσες των δισανθρακικών είναι μεταλλοένζυμα τα οποία καταλύουν την αλληλομετατροπή του διοξειδίου του άνθρακα σε δικαρβονικά ιόντα, σύμφωνα με την αντίδραση: CΟ2 + Η2Ο HCO + H

Τα ένζυμα αυτά απαντούν στους περισσότερους οργανισμούς, συμπεριλαμβανομένων των θηλαστικών, των φυτών των αρχαιοβακτηρίων και των ευβακτηρίων. Οι αφυδατάσες των δισανθρακικών είναι σημαντικές σε πολλές φυσιολογικές διαδικασίες που περιλαμβάνουν αντιδράσεις καρβοξυλίωσης και αποκαρβοξυλίωσης, όπως η φωτοσύνθεση και η αναπνοή. Επιπλέον, λαμβάνει μέρος σε μια πληθώρα βιολογικών διεργασιών, στις οποίες εμπλέκονται η οξεοβασική ισορροπία, η μεταφορά του ανόργανου άνθρακα και η ανταλλαγή ιόντων. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη της έκφρασης κλωνοποιημένου γονιδίου της αφυδατάσης των δισανθρακικών β-τύπου από το αζωτοδεσμευτικό βακτήριο Azotobacter vinelandii στέλεχος AvOP. Στο γένωμα του A.vinelandii AvOP βρέθηκε το γονίδιο AvCAb το οποίο κωδικοποιεί για μια αφυδατάση των δισανθρακικών β-τύπου 343 αμινοξέων με μοριακό μέγεθος 37659,91 Dalton και θεωρητικό ισοηλεκτρικό σημείο (PI) 8,73. Η πρωτεΐνη δεν διαθέτει πεπτίδιο οδηγό και λαμβάνει κυτταροπλασματική κατεύθυνση. Το γονίδιο AvCAb κλωνοποιήθηκε στον φορέα έκφρασης pET28a(+). Εκφράστηκε ετερόλογα σε κύτταρα E.coli BL21 (DE3) και εξετάστηκε το επίπεδο έκφρασης (στο διαλυτό και αδιάλυτο κλάσμα) της ανασυνδυασμένης αφυδατάσης των δισανθρακικών σε τρεις διαφορετικές θερμοκρασίες καλλιέργειας (37ºC, 30ºC και 25ºC). Στη συνέχεια καθαρίστηκε με χρωματογραφία συγγένειας σε στήλη ρητίνης φορτισμένης με νικέλιο (Ni-NTA Resin, Quiagen). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι κατά την μείωση της θερμοκρασίας επαγωγής της ανασυνδυασμένης αφυδατάσης των δισανθρακικών, το διαλυτό τμήμα της παραγόμενης πρωτεΐνης αυξήθηκε. Συγκεκριμένα, κατά την επαγωγή της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης στους 25ºC παρατηρήθηκε υψηλότερη συγκέντρωση του διαλυτού μέρους αυτής, σε σχέση με τις θερμοκρασίες επαγωγής των 37ºC και 30ºC.

Carbonic anhydrases are metalloenzymes that catalyze the interconversion of CΟ2 and HCO according to the equation:

CΟ2 + Η2Ο HCO + H

These enzymes have been found in most organisms including animals, plants, archaeobacteria and eubacteria. Carbonic anhydrases are important in many physiological functions that include carboxylation and decarboxylation reactions, including both photosynthesis and respiration. In addition, carbonic anhydrases participate in a variety of biological activities that involve acid-base balance, the transport of the inorganic carbon and ion exchange. The aim of this study was to over express and characterize a gene encoding for putative b-type carbonic anhydrases in nitrogen-fixing bacterium Azotobacter vinelandii strain AvOP. The whole genome sequence of A. vinelandii strain AvOP revealed AvCAb gene which encodes a putative b-type carbonic anhydrase comprising 343 amino acids with a molecular mass 37659,91 Dalton and tσωheoretical isoelectric point (PI) 8,73. The protein does not include a leader peptide and appears to be located in the cytoplasm. The gene coding for the putative β-type carbonic anhydrase was cloned in pET28a(+) and expressed in E.coli BL21 (DE3). The expression level (soluble and insoluble fraction) was examined using three different incubation temperatures (37ºC, 30ºC και 25ºC). Then, it was purified by affinity chromatography in Ni-NTA Resin column charged with nickel (Ni-NTA Resin, Quiagen). The results shown that the reduction of the temperature used for the induction of bacterial cells containing the cloned carbonic anhydrase, resulted in an increase of the soluble fraction of the carbonic anhydrase. Specifically, the amount of soluble fraction of the produced protein was significantly higher at 25ºC than at 37ºC so as 30ºC.