Μελέτη των ισοενζύμων της μεταφοράσης του γλουταθείου από Phaseolus vulgaris

Abstract

Οι μεταφοράσες του γλουταθείου (GSTs) είναι ένζυμα που υπάρχουν στους περισσότερους οργανισμούς και συμμετέχουν στην αδρανοποίηση εξωγενών ή ενδογενών τοξικών υδρόφοβων και ηλεκτρονιόφιλων ενώσεων, καταλύοντας την αντίδραση δημιουργίας ομοιοπολικού δεσμού μεταξύ αυτών και του γλουταθείου (GSH), συμμετέχοντας έτσι στο μηχανισμό αποτοξίνωσης του κυττάρου. Στις ηλεκτρονιόφιλες αυτές ενώσεις ανήκουν τα ζιζανιοκτόνα και τα εντομοκτόνα. Στην παρούσα διατριβή, μελετήθηκε η μεταφοράση του γλουταθείου σε φύλλα του φυτού Phaseolus vulgaris. Μετά την ανάπτυξη των φυτών σε θαλάμους με ελεγχόμενες συνθήκες θερμοκρασίας και υγρασίας, ψεκάστηκαν τα φύλλα τους με το συστηματικό ζιζανιοκτόνο Fusilade δραστικής ουσίας Fluazifop-p-butyl. Ακολούθως μετρήθηκε η ειδική δραστικότητα U/mg του ενζύμου των φυτικών εκχυλισμάτων του δείγματος και του μάρτυρα αντίστοιχα και στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε καθαρισμός του ενζύμου με τη χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής και συγγένειας. Μετά τον καθαρισμό, όπου παρατηρήθηκε η επαγωγή ισοτύπων GST, ακολούθησε ηλεκτροφόρηση σε συνθήκες μετουσίωσης παρουσία SDS σε πηκτή ακρυλαμιδίου, για την καλύτερη ανίχνευση των πρωτεϊνικών ζωνών των δειγμάτων. Βρέθηκαν τρεις διαφορετικοί ισότυποι, όπου ο ένας (πιθανόν ομοδιμερές) εμφανίστηκε μόνο στα ψεκασμένα φυτά οπότε και μελετήθηκε περισσότερο. Επίσης πραγματοποιήθηκε ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων, η οποία αποτελεί μία μέθοδο που διαχωρίζει το πρωτεϊνικό δείγμα με βάση το ισοηλεκτρικό σημείο και το μοριακό βάρος των ισοτύπων. Στη συνέχεια υπολογίσθηκε η Km του ομοδιμερούς ισοενζύμου και προσδιορίστηκε η Ν- τελική αμινοξική αλληλουχία του.

Glutathione transferases (GSTs) are ubiquitous enzymes, present in most organisms and are involved in the neutralization of xenobiotic or endogenous toxic hydrophobic and electrophilic compounds, catalyzing the formation of covalent complex between themselves and glutathione, therefore contributing in cell detoxification. Pesticides and insecticides are such electrophilic compounds. In this dissertation, we studied the glutathione S-transferase present in Phaseolus vulgaris leaves. Following the growth of Phaseolus vulgaris plants under controlled conditions of temperature and humidity, their leaves were sprayed with the pesticide Fusilade (active substance: Fluazifop-p-butyl). The specific activity (U/mg) of the extracted enzyme from sample and control plants was measured and purified by using ion exchange and affinity chromatography. After enzyme purification, the samples were analyzed by using SDS-PAGE. Three distinct GST isotypes were detected, of which one (a possible homo-dimer found specifically in pesticide-sprayed leaves) was subsequently studied. In addition, 2D-PAGE was performed separating the samples of interest according to molecular weight and isoelectric point. The kinetic constant, Km, for the homodimeric enzyme was calculated, as well as its N-terminal aminoacid sequence.