Tο ιοειδές του λανθάνοντος μωσαϊκού της ροδακινιάς (Peach latent mosaic viroid,
PLMVd) έχει ιδιαίτερη επιστημονική και φυτοπαθολογική σημασία μεταξύ των ιοειδών. Έχει
μοναδικά μοριακά χαρακτηριστικά, είναι ευρέως διαδεδομένο σοβαρό φυτοπαθογόνο
διεθνώς και έχει ένα αμφισβητούμενο από κάποιους ερευνητές κύκλο ξενιστών πέραν της
ροδακινιάς. Τα μηλοειδή και πυρηνόκαρπα, εξ άλλου, βασικές καλλιέργειες μεγάλης
οικονομικής σημασίας διεθνώς και για την Ελλάδα, πέραν του PLMVd, προσβάλλονται και
από άλλα σοβαρά φυτοπαθογόνα ιοειδή, όπως το ιοειδές της εσχαρώσεως του φλοιού του
μήλου (Apple scar skin viroid, ASSVd) και το ιοειδές του εξανθηματικού έλκους της απιδιάς
(Pear blister cancer viroid, PBCVd). Οι πληροφορίες όμως σχετικά με την παρουσία των
ανωτέρω ιοειδών σε καλλιεργούμενα αλλά και αυτοφυή είδη μηλοειδών και πυρηνοκάρπων
και άλλων Rosaceae στην Ελλάδα είναι περιορισμένες.
Η παρούσα έρευνα άρχισε με μία προκαταρκτική επισκόπηση στη Χώρα μας για την
παρουσία των τριών αυτών ιοειδών στα μηλοειδή, πυρηνόκαρπα και αυτοφυή Rosaceae. Στη
συνέχεια, επιλέχτηκε η αναλυτική μελέτη του PLMVd ως κύριο αντικείμενο της διατριβής,
λόγω της ιδιαίτερης σημασίας του, ενώ τα άλλα ιοειδή των μηλοειδών και πυρηνοκάρπων
στην Ελλάδα αποτέλεσαν αντικείμενο άλλης διδακτορικής διατριβής.
Το ASSVd ανιχνεύθηκε σε απιδιές και άγριες απιδιές, καθώς και σε μηλιές και άγριες
μηλιές (Μalus sylvestris). Στα δύο τελευταία είδη αναφέρεται για πρώτη φορά στην Ελλάδα
και διεθνώς, αντίστοιχα. Σε όλες τις περιπτώσεις οι καρποί των φυτών έφεραν τη
χαρακτηριστική συμπτωματολογία. Ως προς το PBCVd, καταγράφηκε υψηλή συχνότητα
παρουσίας του σε φυτά καλλιεργούμενης και άγριας απιδιάς στη φύση, με χαρακτηριστικά
συμπτώματα εξανθηματικών ελκών στο φλοιό του κορμού και των βραχιόνων, ενώ
ανιχνεύθηκε επίσης στην κυδωνιά και τον κράταιγο, στον οποίο η παρουσία του PBCVd
μέχρι σήμερα είχε καταγραφεί μόνο πειραματικά.
Η αναλυτική μελέτη του PLMVd στην Ελλάδα περιλάμβανε την καταγραφή της
παρουσίας του στη ροδακινιά και άλλα Rosaceae στον αγρό και στη φύση, καθώς και στο
φυτωριακό πολλαπλασιαστικό υλικό ροδακινιάς της Χώρας, τον μοριακό χαρακτηρισμό των
ελληνικών απομονώσεων και τη μελέτη των φυλογενετικών τους σχέσεων και, τέλος, την
υιοθέτηση, προσαρμογή, βελτίωση και εφαρμογή στην ανίχνευση του PLMVd
πρωτοποριακών διαγνωστικών τεχνικών.
Ο έλεγχος δειγμάτων ροδακινιάς από τις κυριότερες ροδακινοπαραγωγικές περιοχές
της Ελλάδας αποκάλυψε την παρουσία του PLMVd σε ιδιαίτερα υψηλό ποσοστό (>75%) και
σε αυτό σημαντικό ρόλο φάνηκε να διαδραματίζει το πολλαπλασιαστικό υλικό. Παράλληλα,
επιβεβαιώθηκε η παρουσία του PLMVd στην άγρια και καλλιεργούμενη απιδιά, ενώ
καταγράφηκε, για πρώτη φορά στην Ελλάδα, η παρουσία του στη βερικοκιά, στη δαμασκηνιά
και στην κερασιά και, για πρώτη φορά διεθνώς στην κυδωνιά. Με τη βοήθεια μάλιστα της
xvi
RT-PCR πραγματικού χρόνου (real time RT-PCR), υπολογίστηκε ότι η ανιχνεύσιμη
συγκέντρωση του ιοειδούς στα παραπάνω είδη ήταν κατά μέσο όρο 99.6 % μικρότερη από
την αντίστοιχη συγκέντρωση του ιοειδούς στη ροδακινιά, εξού και η δυσκολία ανιχνεύσεως
του PLMVd στα είδη αυτά.
Επίσης, προσδιορίστηκε η νουκλεοτιδική αλληλουχία 66 συνολικά κλώνων του
PLMVd, το μέγεθος των οποίων κυμάνθηκε μεταξύ 337 και 340 nt, ενώ 62 από αυτούς
αποτελούν νέες παραλλαγές του. Κατά την φυλογενετική ανάλυση δεν καταγράφηκε θετική
συσχέτιση μεταξύ του ποσοστού ομολογίας-βαθμού συγγένειας των ελληνικών παραλλαγών
(variants) του PLMVd με την ποικιλία, το φυτικό είδος και τη γεωγραφική τους προέλευση.
Παρόλ’ αυτά, οι παραλλαγές που δεν προήλθαν από ροδακινιές συναθροίστηκαν σε
ξεχωριστή ομάδα, ενώ όλες μαζί οι ελληνικές παραλλαγές του PLMVd συναθροίστηκαν στην
ομάδα ΙΙΙ κατά Ambros. Ανάλυση της δευτεροταγούς δομής έδειξε ότι η διαμόρφωση των
παραλλαγών του PLMVd ήταν διακλαδωτή (brunched conformation), πλησιάζοντας εκείνη
της πρότυπης παραλλαγής Μ835451 και διατηρώντας στις περισσότερες περιπτώσεις έναν
βασικό πυρήνα με διάφορες δομικές παραλλαγές. Προσδιορίστηκαν, μεταξύ άλλων, οι
περιοχές του γενώματος του PLMVd με τις λιγότερες και τις περισσότερες μεταλλάξεις
καθώς και η επίδραση αυτών στη διαμόρφωση των δομών που συμμετέχουν στην διαδικασία
αυτο-σχάσης κατά τον πολλαπλασιασμό του ιοειδούς.
Στη συνέχεια, το ενδιαφέρον της μελέτης επικεντρώθηκε στην εφαρμογή της
διαγνωστικής τεχνικής RT-LAMP. Μετά το σχεδιασμό και την αξιολόγηση διαφόρων
ομάδων εκκινητών LAMP και τη βελτιστοποίηση του πρωτοκόλλου, ήταν δυνατή η
ανίχνευση του PLMVd στη ροδακινιά και άλλα Rosaceae σε μόλις 30 λεπτά, τόσο στο
εργαστήριο όσο και στον αγρό.
Τέλος, εφαρμόστηκε για πρώτη φορά διεθνώς στη διάγνωση φυτοπαθογόνων, μια νέα
τεχνική, η υγρής φάσεως in situ RT-PCR (liquid phase IS RT-PCR) βασιζόμενη στη χρήση
της φθορίζουσας χρωστικής SYBR Green, με τη βοήθεια της οποίας το PLMVd εντοπίστηκε
στους χλωροπλάστες φύλλων ροδακινιάς όπου άλλωστε είναι γνωστό ότι το PLMVd
πολλαπλασιάζεται και συσσωρεύεται.
Peach latent mosaic viroid (PLMVd) is of high phytopathological and scientific
significance among viroids. It shows very unique molecular characteristics among viroids and
is a serious pathogen widely spread internationally, while its host range Apart from peach is
questioned by some researchers. Pome and stone fruits, on the other hand, basic crops of great
economical significance, in Greece and internationally, are also affected by other serious
viroid pathogens, such as Apple scar skin viroid (ASSVd) and Pear blister cancer viroid
(PBCVd). In Greece, our information about the presence of PLMVd, ASSVd and PBCVd in
cultivated and wild pome and stone fruits and other Rosaceae is limited.
This doctorate thesis started with a preliminary survey in Greece for the presence of
the above mentioned three viroids in pome and stone fruit and spontaneous woody Rosaceae.
Later, the analytical study of PLMVd was selected as the subject of this research, due to the
particular significance of the viroid, while the other viroids of cultivated and wild pome and
stone fruits species became the subject of another doctorate thesis.
ASSVd was detected in pears and wild pears, as well as in apples and wild apples (Μ.
sylvestris), in the last two species for the fist time in Greece and internationally, respectively.
In all cases, the fruits of the plants examined showed the characteristic scar skin
symptomatology. With respect to PBCVd, high frequency was recorded in nature in
cultivated and wild pear with characteristic blister canker symptomatology on the bark of the
trunk and branches, while it was also detected in quince and Crataegus; its presence in
Crataegus in nature is recorded for first time, while previous reports refered to experimental
transmission.
The analytical study of PLMVd included the recording of its presence in peach, other
Rosaceae in the field and in nature as well as in peach nurseries in various parts of Greece, the
molecular characterization of its local isolates and the study of their phylogenetic
relationships, and finally, the adoption/adjustment/improvement and practical application in
the detection of PLMVd of novel and advanced diagnostic techniques.
The examination of peach samples coming from the most important peach-producing
regions in Greece revealed a high (75%) incidence of PLMVd, and, to this, peach germplasm
seemed to play an important role. At the same time the presence of PLMVd in wild and
cultivated pear was confirmed, while its presence in apricot, plum and sweet cherry was
recorded for the first time in Greece, and in quince for the first time internationally. Moreover
using the real time RT-PCR, it was estimated that the detectable viroid concentration in nonpeach
samples was in average 99.6 % lower than in peach. This finding may explain the
difficulty to detect PLMVd in species other than peach.
Sixty six (66) different PLMVd clones were obtained sizing 337 to 340 nt, and their
sequence were identified. Sixty two (62) of these clones were identified as new PLMVd
xviii
variants. Phylogenetic analysis did not reveal any correlation between the homology of
PLMVd Greek variants and their variety, host species or geographical origin. Nevertheless,
almost all PLMVd variants of non-peach samples were grouped in a separate cluster, whereas
all Greek variants obtained classified together in group III according to Ambros classification.
Secondary structure analysis showed that the conformation of the PLMVd variants was
brunched and close to that of the type variant, M835451, having in most cases a basic core
with some local structural differences. Among others, the regions of PLMVd genome of
lower and higher sequence variation were estimated, as well as their influence in
conformations which take part in the self-cleavage mechanism during viroid replication.
Later, the interest of the study was focused on the application of the diagnostic
technique called RT-LAMP. After the design and evaluation of several sets of LAMP primers
and the improvement of the protocol, the detection of PLMVd in peach and other rosaceous
species, both in the lab and in the field, within 30 min only, was possible.
Finally, a new technique called liquid phase in situ RT-PCR, based on the use of the
SYBR Green fluorescent dye, was applied in PLMVd detection. PLMVd was detected in the
chloroplasts of infected peach leaves where, it is known to multiply and concentrate. To our
knowledge, the above technique is used for the first time internationally for the detection of
plant pathogens.
